固定化酶生物探索.docx

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固定化酶生物探索

专题4酶固定化技术

1.概述

1953年Grubhofer和Schleith首先将羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等，用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定。

从60年代起，固定化酶的研究迅速发展，综述和专著大量涌现。

现在，酶的固定化已拥有一套成熟的技术，而且在此基础上，已发展了细胞固定化技术。

近年来，细胞器固定化技术、固定化多酶反应器、固定化微生物多酶反应系统、固定化酶—微生物复合物等技术相继发展起来，因而使生物工程更趋向于相互联系，综合发展。

酶的固定化技术则是这一发展的基础。

1.1固定化酶的涵义

酶是高效性的专一性强的生物催化剂。

但是酶在水溶液中，一般不很稳定；作为催化剂，酶液只能一次性地起作用；若是用于医药或是化学分析，酶必须很纯，如此一次性使用，必然耗资可观。

为了克服这种种缺点，人们开始探索将水溶性酶与不溶性载体联结起来。

使之成为不溶于水的酶的衍生物，又能保持或大部分保持原酶固有的活性，在催化反应中不易随水流失。

这样制备的酶，曾被称为水不溶酶（water-insolubleenzyme）、固相酶（solidphaseenzyme）“boundenzyme”“fixedenzyme”等等。

后来发现，一些包埋在凝胶内或置于超滤装置中的酶，本身仍是可溶的，只是被限定在有限空间不能自由流动而已。

因此，1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”（immobilizedenzyme）这一名称。

所以，固定化酶，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。

1.2固定化酶的优点与缺点

1.2.1优点

固定化酶与水溶性酶相比，具有下列优点：

（1）固定化酶可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高，因而单位酶催化的底物量大增，用酶量大减，亦即单位酶的生产力高。

（2）固定化酶极易与底物、产物分开，因而产物溶液中，没有酶的残留，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。

（3）固定化酶的反应条件易于控制，可以装柱（塔）连续反应，宜于自动化生产，节约劳动力，减少反应器占地面积。

（4）较水溶性酶更适合于多酶反应。

（5）辅酶固定化和辅酶再生技术，将使固定化酶和能量再生体系或氧化还原体系合并使．用，从而扩大其应用范围。

1.2.2缺点

固定化酶虽然有上列优点，但用于工业生产的实例，至今仍然不多。

原因就在于固定酶的应用尚存若干困难或缺点。

⑴固定化酶所用载体与试剂较贵、成本高、工厂投资大，加上固定化过程中酶活力有损失，即酶活力回收率低，更增加了工业化生产的投资困难。

如果用胞内酶进行固定化，还要增加酶的分离成本。

固定化酶在长期使用后，因染杂菌，酶的渗漏，载体降解以及其它错误操作，也会致使酶失活。

⑵固定化酶一船只适用于水溶性的小分子底物；大分子底物常受载体阻拦，不易接触酶，致使催化活力难以发挥。

⑶目前固定化酶尚限于单级反应，多酶反应，特别是需要辅因子的固定化酶技术，还有待开发。

1.3研究固定化酶的理论意义

酶促反应机理的研究，是阐明生物体内各种复杂代谢过程及其调控的基础。

随着分子生物学的发展，现在已愈益清楚地认识到，生物细胞内大多数主要代谢酶，都是定位在生物膜上或亚细胞结构之中，它们在细胞中的这种结合状态，则是构成代谢过程乃至整个生命物质运动的严密有序性的基础。

以往酶学研究中，人们总是把酶从细胞的结合状态分离出来，加以探讨。

酶学在理论上和实践上取得的辉煌成就，表明这种研究方法无疑是必要的，接近真实的。

然而现在确也证明，结合在细脑膜和亚微结构中的酶，在催化性质上，毕竞与水溶状态下的酶存在差异。

为了阐明生物体内的代谢规律，对于这种结合状态的酶，必须用更逼近真实的体系和方法来深入研讨。

而固定化酶，在很大程度上可用作这种研究的理论和实验模型。

固定化酶的研究，有助于了解生物体内膜或凝胶类的微环境对酶功能的影响。

在一定程度上可以说是一种生物模拟。

利用酶的固定化技术，进行调节酶的亚基固定化和重组酶，使一些在溶液状态难于解离为“天然”亚基的酶得以解离，从而确定这些酶的四级结构和亚基功能。

利用酶的固定化技术，可以改变酶的性质。

例如固定化辅因子，使酶不再要求游离辅因子。

在效应物存在下（保护酶）进行化学固定化处理，使酶的构象“冻结”，从而使酶不再受效应物的影响。

在底物存在下进行固定化处理，使其构象“冻结”，从而使酶处于高底物亲和力构象状态。

固定化酶技术转化为亲和色谱技术，应用于分子生物学研究，为酶等生物化学制剂提供快速的分离纯化手段。

固定化酶的动力学研究，还可以为农业化学和土壤化学中常遇到的类似体系，提供有益的启迪，乃至直接借鉴。

固定化酶技术，作为一项新技术，其研究成果，推动了细胞固定化技术的发展。

这就为植物次生物质的工业化生产和基因工程产物的工业化生产，提供了技术基础。

总之，固定化酶，是酶工程的重要组成部分，又是酶工程的一个重要发展阶段。

有人把酶工程分为化学酶工程（亦称初级酶工程）和生物酶工程（亦称高级酶工程）两部分。

固定化酶属于前者。

如果说天然酶的酶制剂是第一代酶，那么固定化酶，则认为是第二代酶。

从酶的实际应用上讲，第二代酶正在登上历史舞台。

第三代酶，将是包括辅因子再生系统在内的固定化多酶反应器，正在迅速发展着，当其用于工业生产时，必将引起发酵工业和化学合成工业的巨大变革。

2.固定化酶的制备

2.1固定化酶制备的一般原则

酶的催化反应取决于它的高级结构及活性中心。

因此一个固定化酶的研制成功，关键在于选择适当的固定方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。

根据有关专著和综述粗略统计，目前已经进行固定化的酶不下100种。

我国研究者也已对30多种酶进行了固定化研究。

这些酶的固定化方法，多种多样，但仍不外乎早已归纳的四大类：

吸附法、载体偶联法、交联法和包埋法。

近年来，在吸附法中报道了电吸附法；在载体偶联法中，发展了多种无机多孔材料。

交联法的双功能试剂，也有一些新的试剂被采用。

微胶囊法也是包埋法的一种，也在材料和方法上有所进展。

表:

各类固定化方法的比较

比较项目

吸附法

包埋法

载体偶联法

交联法

物理吸附法

离子交换吸附法

制备难易

固定化程度

活力回收率

再生

费用

底物专一性

适用性

易

弱

易流失

可能

低

不变

酶源多

易

中等

高

可能

低

不变

广泛

较难

强

高

不可能

低

不变

小分子底物、

医用酶

难

强

低

不可能

高

可变

较广

较难

强

中等

不可能

中等

可变

较广

比较各种类型固定化方法的特点，可以为选择适合的方法提供必要的依据。

上表对各类方法作了简要的比较，在实际工作中若要进行某种酶的固定化研究，首先必须对酶的性质有所了解，然后根据实际条件和要求，选择适当的固定化方法，这样才可能得到预期的效果。

这里所说的酶的性质，主要是酶的稳定性，包括热稳定性、pH稳定性、对某些化学试剂的敏感性；酶的活性中心和必需基团的性质，酶的抑制剂和激活剂，都应有所了解；对载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等，都应有所了解。

如果是制备生产上应用的固定化酶，显然必须侧重考虑各种制备用试剂和原材料易得、便宜；制备方法简便易行的原则。

若是作理论研究，则另当别论。

酶固定化之后，首先应当测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。

研究它的最适反应条件（底物浓度、pH值、温度、离子强度等）；固定化酶的稳定性和不稳定原因的探究，以便能改善载体微环境的物化性质；对酶进行人工修饰，使其与载体的结合，达到较为理想的构型和相容性,人为地得到最优化的催化结构，使固定化技术，从自在阶段过渡到自为阶段，正是目前人们追求的目标之一。

2.2酶的固定化方法

2.2.1吸附法包括物理吸附法和离子交换吸附法。

⑴物理吸附法各种物理吸附法使用的载体，通常都有巨大的比表面，因而存在巨大的表面剩余能，能够吸附其它物质，其中包括酶。

这种吸附作用选择性不强，吸附不牢。

常用于酶固定化的载体（吸附剂）有：

无机载体，如活性氧化铝、活性炭、皂土、硅藻土、高岭土、多孔玻璃、硅胶等；有机载体，如：

面筋、淀粉、纤维素、胶原、赛璐珞和火棉胶等。

无机吸附剂的吸附容量一般很低，常小于lmg（蛋白）／克（吸附剂），少数有达17mg者，如氧化钛钦包被的不锈钢粒（直径100—200μm），吸附β-半乳糖苷酶即是。

有机吸附剂的吸附容量要高一些，常达数十毫克／克（吸附剂）、如火棉胶膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸酪酶等，可达70mg（蛋白）·cm-2（膜）；每l克胶原膜，可吸附溶菌酶服酶、葡萄糖氧化酶50mg之多。

国产微孔玻璃载体吸附葡萄糖淀粉酶，得到4％一8％的蛋白含量，是一种优良的载体。

无机吸附剂在固定化之后，常引起吸附变性，损失活力回收率。

有人将糖化酶与阴离子表面活性剂反应后，再用活性炭吸附，酶活力高，且长期稳定。

用多孔硅（CPGl00，孔径100nm）固定化α-淀粉酶和糖化酶时，添加钛盐所制备的固定化酶，其活力比用戊二醛交联法制备者高两倍。

这说明无机吸附剂配合其它方法使用，可能更好。

可惜这方面的规律性知识很少。

⑵离子交换吸附法

这是一种电性吸附。

常用的载体有：

DEAE-纤维素、CM-纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶，还有DEAE—纤维素、AmberliteIRA-93、纤维素-柠檬酸盐、IR—50、120、200、Dowex-50等。

这类载体一般每克可吸收50-150mg蛋白。

中国科学院微生物所固定化酶组，用DEAE—SephadexA-50吸附葡萄糖淀粉酶，固定化酶的表观活力为1400U·g-1,天津工业微生物所，以强碱阴离子交换树脂290制备葡萄糖异构酶，固定化酶活力达9000-15000U·g-1,活力回收率86％一92％，果糖转化率42％。

2.2.2包埋法

将酶分子包埋于凝胶的网眼中或半透性的聚合物膜腔中，以达到固定化之目的的方法，即称包埋法；

⑴格子型包埋法常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶、硅橡胶、卡拉胶，还有人用过大豆蛋白质、合成纤维。

王厚行等先后报道用廉价的PVC（聚氯乙烯）包埋脲酶和乳酸脱氢酶，制备酶电极，效果优于聚丙烯酰胺包埋法。

以聚丙烯酰胺（PAG）包埋法为例，包埋酶的制备与PAGE凝胶制备类同。

即将lml溶于适当缓冲溶液的酶液，加于3m1含750mg丙烯酰胺单体和40mgN，N’—甲叉双丙烯酰胺的溶液中，再加0.5ml5％的二甲氨基丙氰和1％的过硫酸钾，作为加速剂和引发剂，混匀保温（23℃）10min，即成含酶凝胶。

此胶孔径1.0—4.0nm，底物和产物可进出凝胶网眼，而酶分子不透出。

FAG的包埋容量在10一100mg（蛋白）·g-1（单体）之间。

⑵微囊型包埋法

本法是以超滤用的半透膜包裹含酶的液滴而成；它大多用于医疗。

例如天冬酰胺酶，就可以做成囊型酶使用。

微囊包埋法按制作特征可分为界面聚合法、液体干燥法、分相法和液膜（脂质体）法四种。

①界面聚合法是将疏水和亲水单体，在界面进行聚合，使酶包被其中而成。

具体方法：

将酶的水溶液和亲水单体，用一种与水不混合的有机溶剂作成乳化液，再将溶于同一有机溶剂的疏水单体溶液，在搅拌下加入上述乳化液中。

在乳化液中的水相和有机溶剂相之间的界面发生聚合反应，这样，水相中的酶即包被于聚合膜内。

例如，将亲水单体乙二醇或多酚与疏水单体多异氰酸结合而成聚脲膜。

用聚脲制备天冬酰胺酶、脲酶等微囊。

②液体干燥法是将一种聚合材料溶于一种沸点低于水、且不与之混合的溶剂中，加入酶的水溶液，并用油溶性表面活性剂为乳化剂，制成乳化液。

此为“水在油中”乳化液，把它分散于含有明胶（或丙烯醇）和表面活性剂的水溶液中，形成第二乳化液。

在不断搅拌下，真空干燥，即成含酶微囊。

常用的聚合材料为乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡胶等。

常以苯、环己烷和氯仿为溶剂。

此法曾制备过氧化氢酶、脂肪酶等的乙基纤维素和聚苯乙烯微囊，微囊制备的酶几乎不失活。

但很难完全除去残留的有机溶剂。

囊的直径几十到几百微米，膜厚约25nm，大小可由聚合物浓度、乳化速度和保护性胶的选择任意调制。

③分相法又称界面凝聚法是利用某些高聚物在水相和有机相界面上有极低溶解度，因而易形成皮膜将酶包被的方法。

例如将含酶水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳化分散，然后一边搅拌，一边滴加能和乙醚互溶但不能溶解硝酸纤维素的另一有机溶剂苯甲酸丁脂。

这时乳化液滴周围的硝酸纤维素凝聚成膜囊，而将酶的水溶液包围其中。

如以乙基纤维素为材料，则用四氯化碳溶解，而用石油醚使乳滴凝聚成囊。

④液膜法或称脂质体（Liposome）法是由磷脂分散于酶水溶液而形成脂质囊包埋酶液的方法。

此法的最大特征是底物和／或产物穿过液膜时，与膜的孔径无关，而与其对膜组分的溶解度有关。

因此，其用途将有新的发展。

2.2.3载体偶联法（共价法）

此法是将酶分子的必需基团经共价键与载体结合的方法。

就蛋白而言，可供反应的非必需侧链基团有一NH2、一OH、一COOH、一SH2、酚环、咪唑基、吲哚基。

就载体而言，常用的载体，有多羟基聚合物如纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖等；多胺基聚合物，如聚丙烯酰胺凝胶、多聚氨基酸。

还有一些其他的载体如聚苯乙烯、尼龙、多孔玻璃等。

这些载体的功能基团有：

芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基和氨基等。

酶分子侧链与载体功能基之间，往往不能直接反应，因而反应前必须事先将载体功能基团加以活化，然后与酶分子反应而固定化。

活化和偶联反应多种多样，这里择要介绍几种。

重氮化法这是一类应用较广的方法，适用于多糖类的芳香族氨基衍生物、氨基酸共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、乙烯二马来酸共聚物和多孔玻璃等载体。

载体先用亚硝酸处理，生成重氮盐衍生物，然后在温和条件下与酶分子的酚基、咪唑基或氨基反应而成键。

2．2．4交联法

利用双功能或多功能试剂，使酶分子之间或酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联，凝集成网状结构，而成固定化酶，此即交联法。

双功能和多功能试剂，功能基团相同的，例如戊二醛、二重氮联苯胺－2，2’—二磺酸等为“同型”双（多）功能试剂。

功能基团不相同者如1，5—二氟—2，4—二硝基苯等，为“杂型”双（多）功能试剂。

戊二醛是应用最广的双功能试剂，它与酶的游离氨基反应，形成Schiff碱而使酶分子交联：

交联法单用时，所得到的固定化酶，颗粒小、机械性能差、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。

例如使用明胶（蛋白质）包埋，再用戊二醛交联，或先用尼龙（聚酰胺类）膜或炭等吸附后，再交联。

例如，武汉生物制品研究所生化室，用氨基乙基纤维素和戊二醛结合法，制备固定化胰蛋白酶及胃蛋白酶。

交联法是利用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与载体之间发生交联反应,制成具有网状结构的固定化酶的方法。

最常用的双功能试剂是戊二醛,戊二醛有;两个醛基,这两个全集醛基都可以与酶蛋白分子上的游离氨基发生反应,戊二醛本身起到分子间桥作用。

反应式如:

OHC－（CH2）3－CHO＋n[E]=－CH=N－E－Ｎ＝CH－－－

利用戊二醛作交联剂进行酶固定化具有以下特点:

A戊二醛与蛋白质的反应迅述,一般在1小时内即克完成反应。

B反应受基质的离子强度有关,反应的pH范围较广,能在pH5-9进行。

C交联反应,是不可逆的。

酶固定化载体的再生比较困难。

D在利用戊二醛进行交联反应时,不仅有分子间交联反应,而且同时发生分子内交联反应,在酶固定化后,对酶分子的稳定性有较大的改善,但由于发生供价反应,在固定化后有部分酶蛋白失活。

2.2.5吸附交联法

吸附交联法所用的载体与吸附法的载体基本一致，从交联反应原理不难理解,戊二醛的醛基与酶蛋白的游离氨基发生反应,因此,对于大部分载体来说,在固定化反映时,反应体系中,主要是酶分子内或分子间的交联反应,酶蛋白与载体之间的反应较少；所以目前用的最多的是吸附交联反应,即将吸附和交联反应结合起来,首先将酶蛋白吸附到载体上,然后再加入交联剂戊二醛,使酶蛋白分子形成网格结构,牢固地附着在载体上。

吸附交联法固定化酶蛋白的基本操作过程:

⑴吸附条件测定:

主要包括基质的离子强度、pH、酶蛋白与载体的最佳比例、吸附完成时间。

⑵吸附,在测定吸附条件后,进行酶蛋白的吸附,在进行吸附时,要进行不断的搅拌,但搅拌的述度不能太快,太快反而不利于吸附进行。

⑶加交联剂:

交联剂的用量因不同的酶蛋白而不同,交联剂加入量不够,交联反应进行不完善,酶固定化反应不牢固,交联剂加入过多,过渡的分子内交联反应,影响酶活收率；交联反应时间一般1小时即可完成（戊二醛作交联剂）。

⑷固定化酶的洗涤,除去游离酶,测定固定化酶的酶动力学参数和酶活收率。

实例:

利用离子交换树脂（DowexMWA-1）固定化碱性蛋白酶:

A载体处理:

70%的乙醇浸泡30min,用蒸馏水洗涤除去乙醇,1N氢氧化钠浸泡30min,蒸馏水洗致中性,3N盐酸浸泡30min,蒸馏水洗致中性,最后用1/15NpH6.5的磷酸buffer平衡。

B吸附:

4ml酶蛋白溶液（10mg/ml）与1g载体混合,待吸附完成后,加入等体积的10%的戊二醛,0℃60min即可完成交联反应。

C洗涤除去游离酶:

用上述buffer反复洗涤,将游离酶除去,测定碱性蛋白酶的酶活收率为27%。

2.3需辅酶的酶的亲和固定化

需辅酶的酶，其酶蛋白和辅酶之间、有较强的亲和力，因此这类酶的固定化，可以用演化氰活化法或重氮化法或烷基化法，直接将酶蛋白共价结合于载体。

为维持正常的催化作用，必需不断向反应系统补充辅酶。

另一种方法是将辅酶固定化，然后将酶蛋白亲和吸附上去。

不过这种吸附结合力很弱，还不足以达到固定化目的。

因此，还要用适当的方法将其加固，而加固措施又会丧失活性中心或必需基团。

可见，这种亲和固定化法，适用于多亚基（多活性中心）的酶，固定化用去其中之一，还有其他亚基可行使催化功能。

例如色氨酸酶（Trpase）为4亚基、4个活性中心。

酪氨酸酶（Tyrase）也是4亚基，但只有2个活性中心。

它们都以磷酸毗哆醛为辅酶。

有人将磷酸毗哆醛（Py）偶联于琼脂糖上，然后利用它的4位醛基（注意，这是催化功能基团）与酶蛋白的ε－NH2形成Schiff碱而固定化。

并用NaHB4将Schiff碱还原而加固：

对于Trpase而言，固定化后，回收率80％，相对活力为60％，对丁yrase而言，相对活力降低率就大了（因为只有两个活性中心，理论上就应丧失50％）。

显然，亲和固定法对于活性中心多的酶，是有实际意义的；活性中心较少的酶，则应另寻路践。

需辅酶的酶，第三条固定化路线，就是将酶蛋白和辅酶分别固定化，再将其混合后，一并放于半透膜内。

2.4固定化多酶反应系统

上述酶反应，都是固定化单一的酶反应。

细心的读者，很容易想到，例如上述需辅酶的酶，即使将辅酶固定化，以减少昂贵的辅酶流失，但辅酶参与反应后，发生了氢或其它基团转移，如不再生，还需补充。

又例如，某些产品的生物合成，需要多步酶促反应才能完成。

于是人们想到了制备固定化多酶反应系统，是固定化酶实际生产性应用的当务之急。

作为机体代谢调控的理论研究，也需要固定化多酶反应系统进行模型研究。

近年来，这方面已经取得了很大的进展。

例如辅酶再生系统，有醇脱氢酶—NAD—乳酸脱氢酶固定化反应系统，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-NAD-苹果酸脱氢酶（MDH）（或谷氨酸脱氢酶）固定化反应系统，心肌黄酶—NAD—乙醇脱氢酶固定化反应系统。

苹果酸脱氢酶—乳酸脱氢酶；柠檬酸缩合酶（CS）—NAD反应系统等等。

如图示，是其中一例。

这个反应系统，不仅是NAD再生系统，而且因MDH和CS固定化于同一载体，MDH催化反应的产物，草酰乙酸由CS催化，迅速与乙酰CoA反应生成柠檬酸，克服草酰乙酸对MDH的产物抑制，使柠檬酸产率提高l倍，再加上LDH，三酶固定化体系使柠檬酸增加了三倍。

NADNADH

LDH

图辅酶再生多酶系统（虚线示意胶囊）

3．固定化酶的性质

从溶液酶的游离状态，到固定化酶的“局限”状态，是一个很大的转变。

不仅酶分子本身，而且酶反应的环境也有所不同。

因而，固定化酶的性质与溶液酶大相径庭。

下面分别就固定化对酶反应系统的影响，固定化酶的动力学性质和稳定性等，作一简要讨论。

3.1固定化对反应系统的影响

固定化酶的制备方法很多，酶在固定化过程中，对酶反应系统产生的影响各不相同。

但若假定：

（1）酶固定化之后，在载体表面或多孔介质内的分布完全均匀；

（2）整个系统各向同性，则可以将讨论对象大为简化，这样就可以将固定化带来影响概括为如下三个方面：

3.1.1构象改变、立体屏蔽

酶在固定化过程中，由于酶和载体之间相互作用，引起酶分子构象发生某种扭曲，从而导致酶与底物的结合能力或催化底物转化能力发生改变，在大多数情况下，固定化致使酶活性不同程度下降。

在共价结合法和吸附法制备固定化酶时，表现尤为突出。

立体屏蔽是指固定化后，由于载体孔隙太小，或固定化的结合方式不对（如图所示）使酶活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使效应物或底物与酶的邻近或接触受到干扰。

因此，选择载体的孔径不可忽视。

采用载体加“臂”的方法，亦能改善这种立体屏蔽的不利影响。

图固定化酶的立体屏障效应

3.1.2分配效应和扩散限制

这两种效应都和微环境密切相关。

所谓微环境是指紧邻固定化酶的环境区域，主要是载体的疏水亲水及电荷性质带来的影响。

分配效应是由于载体性质造成的酶的底物或其他效应物在微观环境和宏观体系之间的不等性分配，从而影响酶促反应速度的一种效应。

这种效应，可以用分配系数进行定量描述。

扩散限制效应是指底物、产物和其它效应物在环境中的迁移运转速度受到的限制作用。

有外扩散限制和内扩散限制两种类型。

前者是指物质从宏观体系穿过包围在固定化酶颗粒周围近乎停滞的液膜层（又称Nernsl层）达到颗粒表面时所受到的限制。

内扩散限制是指上述物质进一步向颗粒内部酶所在点扩散所受到的限制。

扩散限制效应可通过引入相应的参数和模量，进行定量讨论。

3.1.3微扰（perturbation）

由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质，直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力，这种效应称为微扰。

目前还不能作定量描述。

实际上构象改变，立体屏蔽效应，也还不能作定量描述。

近年来，关于蛋白质“可及表面”计算方法的进展，似为这几种效应的定量讨论，展示了一种前景。

以上效应将具体表现在酶的动力学性质、酶的稳定性、酶促反应影响因素、乃至酶的底物专一性等方面。

3.2固定化酶的动力学性质

固定化酶的动力学性质，已在一些专著中作过定量讨论。

实际上目前主要论及分配效应和扩散效应，对动力学参数的影响。

这里不拟引述繁复的数学推导，仅就这些论述导出的主要结论，作简要的介绍。

3.2.1分配效应的影响

这种影响通常用分配系数（ρ）来描述：

ρ＝[Si]／[S]

（1）

式中[Si]和[S]分别表示底物或其它效应物在微环境中的局部浓度和宏观体系中的总体（或平均）浓度。

对最简单的固定化酶系统而言，其动力学性态，一般仍服从米氏方程。

当反应系统进行充分搅拌，消除外扩散限制影响时，只考虑分配效应的影响，则反应速度可表示如下：

Vmax[Si]

v=

（2）

Km+[Si]

Vmax[S]ρ

=（3）

Km+[S]ρ

Vmax[S]Vmax[S]

==（4）

Km/ρ+[