抗生素微生物检定管碟法在中国药典版的应用及操作要点.docx

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抗生素微生物检定管碟法在中国药典版的应用及操作要点

抗生素微生物检定法可分为：

（1）稀释法；

（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。

各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。

    管碟法：

利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

    此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

    原理：

利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。

管碟法的操作步骤：

    1、预试验：

确定最佳的试验条件：

调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：

一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。

    2、试验准备：

双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。

    3、双碟的制备：

每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。

    4、供试品、标准品溶液的制备：

估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。

    5、菌层的制备：

注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。

    6、滴加抗生素溶液：

注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。

    7、双碟的培养：

根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。

    8、抑菌圈的测量：

抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。

手工测量：

游标卡尺

    9、结果的可靠性检验及效价测定：

抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。

操作要点

    第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。

    溶解：

对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。

    标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。

    试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。

故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。

    一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。

对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。

    试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。

芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。

    加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。

如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。

对于加入菌悬液体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。

    在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气泡。

    加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为65℃，对非芽孢悬液时，菌层培养基的温度一般为48～50℃。

    放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。

    抗生素原料药：

不含辅料的药物制剂原料，一般其效价以纯度（u/mg或µg/mg）表示。

检验时，可参考该品种的药品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计效价，取样试验，如估计效价与实际效价相差较远时，即测定所得效价超出估计效价的±10%时，则重新估计效价，再做准确测定。

    粉针剂：

指注射用无菌粉末或冻干品，用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓶内，一般测定其纯度（u/mg或µg/mg）或整瓶效价。

    取装量差异项下的内容物，称取适量（50mg以上，根据标示量及平均装量折算估计效价，并按估计效价及量瓶体积计算取样量），置量瓶中，加标准中规定的溶剂溶解，稀释，测定，计算出1mg的效价单位数，再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量。

水针剂（注射液）：

即抗生素的灭菌水溶液，标示量一般按每毫升含效价单位计。

    效价测定时，量取平均装量项下的内容物或5～10支的内容物，混匀，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品，将吸管外壁用滤纸拭净，再弃去多余的溶液，使供试品至吸管刻度，沿量瓶颈部内壁缓缓流入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内，混匀，继续加溶剂至刻度，摇匀，再量取适量稀释至规定的浓度。

    素片、薄膜衣片：

称取20片的总量，求出平均片重，研细混匀后，精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量），置量瓶中，用标准中规定的溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀。

再量取适量稀释至规定浓度。

    注意点：

研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应读取辅料下层的溶液切面；如沉淀较多，须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素，应加以注意。

为节约供试品，可与重量差异检查结合进行。

    糖衣片、肠溶片：

取标准中规定的片数，置于乳钵中，研细，分次加入规定的溶剂，研磨使其溶解，将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶体积根据供试品标示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000单位/ml）选定，用规定溶剂稀释至刻度，摇匀，静置，使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内，精密吸取量瓶中的上层液适量，作进一步稀释。

个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片，可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液。

    胶囊剂：

取装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，根据平均装量，精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，如供试品含有较多的辅料，则照片剂项下的方法进行。

    颗粒剂、干混悬剂：

取装量差异项下的内容物，混匀，根据平均装量，精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

量取适量稀释制成供试品溶液。

测得效价后，再根据装量差异项下的平均装量，计算出平均每袋（包）的效价，根据标示量即可算出含量。

    软膏剂、眼膏剂：

擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁，切开封口，置于干燥器内约1小时，取干燥的洁净分液漏斗，带手套操作，将膏剂软管连同内容物在天平上称重，取出，将内容物挤入分液漏斗，量约2g，再称取膏剂软管的重量，按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏剂供试品的量，以不含过氧化物的乙醚或石油醚等作溶剂溶解基质，但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中，以避免提取过程中抗生素的损失。

按标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中，振摇，使基质溶解，用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中，用缓冲溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加缓冲溶液至刻度，依法操作，计算效价。

实验要点

    磷霉素钠，磷霉素钙，磷霉素氨丁三醇

    主要问题：

抑菌圈偏小

    解决：

1.pH9.0抗Ⅱ号培养基（pH7.8～8.0）

2.滴加药液后，室温放置1小时后，放入孵箱内培养。

3.培养时间以24小时为宜，培养时间短，抑菌圈清晰度不好，培养24h后如抑菌圈仍不清晰，应室温放置一段时间待清晰后再测量。

啤酒酵母菌的培养

    主要问题：

生长不良

    CP2005：

抗Ⅴ号琼脂斜面及抗Ⅳ琼脂斜面

    解决：

1.采用沙氏或YPD酵母菌培养基；2.32～35℃培养24小时

    沙氏培养基

蛋白胨10g葡萄糖40g

琼脂13g水1000ml

调节灭菌后pH5.4～5.8

    YPD培养基

蛋白胨10g葡萄糖40g

酵母粉5g琼脂13g

水1000ml

管碟法特点：

    优点：

基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。

    缺点:

凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。

管碟法抗生素效价测量

管碟法抗生素效价测量-简介

抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。

管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

管碟法抗生素效价测量-原理

当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。

因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。

根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。

北京潮声公司具有同行业的领先水平。

在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下：

管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法【1】，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。

但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。

根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。

管碟法抗生素效价测量-实验

1.实验器材的准备

1.1实验器材的选择

试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。

可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。

小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。

如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。

1.2实验器材的清洗

抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。

由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。

因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。

160℃干热灭菌2h后备用。

2.配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基

2.1样品与标准品溶液的配制

标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。

供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。

称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。

标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。

天平中的干燥剂应保持经常注意更换。

称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。

稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。

用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。

把稀释后的抗生素溶液分装至干燥灭菌试管待用。

在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。

所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。

2.2培养基与缓冲液的配制

配制培养基与缓冲液时要按照文献的配比用量，配制后调节其pH值。

因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。

例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响【2】。

培养基可以购买厂家生产的产品，因为大批量产品中的成分配比较稳定，可比性较强。

116℃湿热灭菌20min后备用。

3.加注培养基

3.1加注底层培养基

无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。

菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。

我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。

在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。

接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。

这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。

试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。

加注60～80℃的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。

因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。

3.2加注培养基菌层

制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。

当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。

因此，培养基应放在50℃水浴中保温。

当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。

在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。

因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50℃水浴锅内保温。

试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂。

震荡混匀后继续保温5min使培养基温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养基均匀铺开。

4.放置小钢管

放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。

管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。

可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的问题。

小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。

放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。

5.滴加抗生素溶液

滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法）或者SH→TH→SM→TM→SL→TL（三剂量法）的顺序滴加【3】。

滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。

在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。

因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。

滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。

在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。

此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。

换滴管重新滴加。

抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。

（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。

）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。

6.双碟中菌株的培养

滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。

在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。

双碟在37℃下培养约16h。

时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。

在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。

所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。

培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。

应经常注意温度，防止意外过冷过热。

7.抑菌圈测量

7.1试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。

批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。

如若菌株不纯，也会造成这样的结果。

因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。

7.2用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。

不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。

不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。

记录测量结果后进行效价计算。

管碟法测定抗生素效价

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admin发布时间：

2008-4-3阅读：

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一、目的和要求

　　1、了解管碟法的原理。

　　2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。

二、原理

　　抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。

管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

　　当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。

因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。

根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。

三、实验材料

　　1、四环素类抗生素的标准品和样品。

　　2、试验菌：

藤黄八叠球菌（Sarcinalutea）。

　　3、培养基：

250ml三角瓶分装150mlLB琼脂，150ml三角瓶分装50mlLB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。

　　4、灭菌物品：

培养皿，牛津杯（内径：

6.0±0.1mm，外径：

7.8±0.1mm，高度：

10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。

　　5、其它：

分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。

四、实验实施

　　1、配制标准品溶液

　　2、配制样品溶液

　　3、制备菌悬液。

　　4、制备平板：

（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。

（2）另取冷却至50℃左右的50mlLB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。

　　5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。

　　6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。

　　7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。

　　8、用游标卡尺测量抑菌圈直径

5.多粘菌素E效价测定

本实验用不同浓度的多粘菌素E溶液作标准曲线，以抑菌圈直径的平方值为横坐标，多粘菌素E标准品效价的对数值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。

具体作法如下：

（1）大肠杆菌菌悬液制备取活化的大肠杆菌A1.543菌种接种于大肠杆菌活化培养基斜面，37℃培养24h，然后每支斜面加无菌生理盐水10mL，刮下菌苔，搓匀。

（2）倒底层平板将灭菌的2%琼脂水底层培养基加热融化后，冷凉至45~50℃左右，倾倒入培养皿制成底层平板，每人2～3个，凝固后于皿底贴上标签。

（3）制备混菌上层平板将检测用上层培养基加热融化后，冷凉至50℃左右，50mL上层培养基加入大肠杆菌菌悬液0.5mL，轻轻摇匀。

在每一培养皿底层平板上加入10mL混菌上层培养基（动作迅速，以免培养甚中琼脂凝固；倾倒上层培养基时不要有气泡。

若有气泡应赶到平板边缘），凝固后成上层平板即为双碟备用。

制备双碟时必须在水平的桌面上，并选择平底的培养皿。

贴好标签的培养皿，放于白瓷盘上。

（4）滴加多粘菌素E标准品和样品先将10000u／mL的标准多粘菌素E，用1/15mol／LpH6.0磷酸缓冲液稀释成800、1000、1200u／mL。

根据酸化后滤液颜色粗略估计发酵样品效价，用1/15mol/LpH6.0的磷酸缓冲液稀释至1000u／mL。

每人取制备好的2～3个双碟，打开皿盖，用无菌镊子夹取已灭菌的钢管（牛津杯），每个双碟中放置钢管6个（如图5－1～2所示）。

其中相间隔的3个钢管滴加多粘菌素E标准液。

另外3个钢管滴加发酵液样品。

A管中用无菌滴管滴加多粘菌素E800u／mL的标准液，B管滴加多粘菌素E1000u/mL的标准液，C管滴加多粘菌素E1200u／mL的标准液，D管滴加发酵样品稀释液。

滴加时必须仔细小心，勿在小钢管中形成气泡，勿使溶液流出管外，加的量各管要一致，恰好滴满。

滴加完毕后，加上灭菌陶瓷盖。

将放双碟的白瓷盘小心平端于37℃恒温箱内，培养6～8h后取出。

（5）抑菌圈直径的测量及校正将双碟中的钢管倒入白瓷缸中，加洗涤灵和水，然后煮沸0.5h，清水冲洗晾干。

用玻璃皿盖换下白陶瓷盖，然后用卡尺测量双碟中每管抑菌圈的直径。