蛋白质主要降解途径细胞自噬的分子机制及功能.docx
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蛋白质主要降解途径细胞自噬的分子机制及功能
项目名称：
蛋白质主要降解途径-细胞自噬的分子机制及功能
首席科学家：
刘玉乐清华大学
起止年限：
2011.1至2015.8
依托部门：
教育部
二、预期目标
本项目的总体目标：
本项目围绕细胞自噬研究中关键的科学问题细胞自噬的分子机理和功能开展研究，聚焦于哺乳动物全基因组范围细胞自噬新分子的鉴定及功能分析、细胞自噬在动物个体发育中的功能研究，细胞自噬在人类肿瘤和自身免疫中的作用，以及细胞自噬在植物发育、病原-寄主相互作用中的作用，在不同生物模式中系统地开展细胞自噬领域的基础研究，揭示细胞自噬的分子机理和功能，在细胞自噬研究上取得若干突破，产出与我国日益增长的国力相称的重要科学成果，对我国的国民经济发展、人民健康产生积极的推动作用；同时建立和培养一支具有国际领先水平的细胞自噬研究队伍。
五年预期目标:
（1）在多种模式生物中鉴定一批新的细胞自噬分子，鉴定其分子结构和功能及其与已知Atg蛋白的相互作用，进一步阐述自噬体膜的来源，以及自噬性溶酶体再生的分子机制，获得一批原创性的成果；
（2）在现有的基础上，建立细胞自噬研究的平台技术体系，重点加强以多种模式生物为基础建立细胞自噬分子筛选体系，进一步强化自噬体体外重装的关键技术，并争取实现若干关键技术的自主创新；
（3）阐述细胞自噬的异常与发生人类重大疾病的相互关联，针对我国多发的癌症、免疫性疾病种类，寻找一些以细胞自噬为基础的新药物靶标或新的生物标记物，获得一批有自主知识产权的研究成果；
（4）通过培养博士后和博士研究生，扶植一批在细胞自噬研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家，造就一支结构合理、具备攻坚能力的国际先进水平的研究队伍；争取培养国家杰出青年基金获得者2～3，长江学者1～2名。
（5）以研究论文和独立开发的技术成果（专利）的形式公布项目研究成果，五年内争取发表影响因子大于5的SCI刊物上发表学术论文50篇左右，在国际高水平杂志（影响因子大于10）上发表论文4-6篇，力争在国际顶尖杂志Cell,Nature或Science上发表论文，并申报专利3-5项。
三、研究方案
一、学术思路
本项目的一个核心思想是根据细胞自噬分子在不同模式生物中的高度同源性，利用各系统分别所具有的优势，运用一系列分子生物学、细胞生物学、遗传学等手段，对新鉴定出的细胞自噬分子进行系统地研究。
并基于多种模式生物建立一定规模的细胞自噬研究的平台，从蛋白质-蛋白质、蛋白质－脂类相互作用、蛋白质定位、转位、运输、蛋白质降解以及细胞自噬膜组成成分的动态变化入手，在分子、细胞以及个体水平等多层次阐明细胞自噬的分子机理和信号调控机制，并在整体水平上阐明这些蛋白在动植物生理活动、重大疾病中的作用，深入探讨潜在的临床应用价值。
可望在细胞自噬研究上取得若干突破，提升我国细胞自噬的水平和国际影响力，使我国该领域在国际上占据重要的地位。
二、技术途径：
（1）本研究采取系统筛选和重点研究相结合的方法，在多种系统中筛选鉴定细胞自噬相关蛋白，然后针对个体蛋白进行重点研究；
（2）本课题采用多层次、多空间尺度的研究手段，在分子水平上研究蛋白-蛋白相互作用，蛋白-脂类相互作用，在细胞生物学水平上研究蛋白的修饰、定位、降解以及在细胞自噬中的作用。
在个体水平上研究这些蛋白对不同模式生物的发育、重要生理功能的影响以及在重要疾病中的作用
（3）本研究采用多系统、多手段综合的方式对主要科学问题进行多层次、多角度的研究，利用线虫、哺乳动物细胞和植物各自具有的优势和特点，对细胞自噬这一在进化上保守的生命活动进行跨系统的综合研究。
（4）本课题将进行遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物化学和发育生物学等多学科的交叉，利用突变体库筛选、RNAi文库筛选、蛋白-蛋白相互作用分析，静态、动态显微成像，数学建模等一系列前沿手段，对主要科学问题进行跨学科的深入研究
（5）本课题将动态和静态结合，利用活细胞，使用多光子、高分辨、萦光共聚焦显微成像系统等，对蛋白在细胞自噬的细胞生物学过程中的作用进行高时间分辨率的实时动态观察。
利用TIRF、STORM等新兴显微技术对蛋白在自噬体上进行超高空间分辨率的定位，从时空上对目的蛋白在细胞自噬中的作用进行研究
（6）离体和在体的结合，利用重组蛋白建立自噬体外重建系统，利用纯化的目的蛋白深入研究其作用机制，并在细胞水平上进行在体实验验证。
三、创新点与特色：
（1）细胞自噬新基因的高通量筛选，以及功能研究的技术平台具有一定创新性，筛选方法技术也有显著改良等。
（2）新的具有潜在药物靶标和生物标记物的细胞自噬分子的鉴定，将申请具有自主知识产权的专利。
（3）采用多系统、多手段在不同模式生物对新细胞自噬分子进行跨系统的综合研究，为从蛋白水平、亚细胞和细胞水平、个体水平研究生命活动和规律提供新的思路，有利于揭示自主发现的新型细胞自噬分子在疾病发生、发展过程中的作用及其潜在的临床应用前景，为重大疾病的预测、诊断、治疗，以及农作物产量和品质的提高提供科学依据和新的增长点，形成源头创新和自主知识产权的研究成果，研究内容新颖，意义重大。
（4）该项目整合我国细胞自噬及相关分子细胞学研究领域的优势实验室，联合攻关，较好地体现了多学科的交叉综合研究优势。
四、可行性分析：
1.参加项目的各个课题组，近几年来在细胞自噬新分子的鉴定和功能研究方面积累了丰富的研究经验，并取得了令人瞩目的研究成果。
通过高水平论文的发表，已经获得国内外学术界的承认，知名度甚高。
例如：
1）刘玉乐教授在植物细胞自噬研究方面取得了开创性的工作，在国际上首次发现在植物抗病反应中，细胞自噬在限制病原（包括病毒，细菌，真菌）诱导的细胞死亡到病原侵染点起关键作用（Liuetal,Cell,2005），提出细胞自噬在植物抗病反应中是细胞死亡的负调控因子，是植物面对病原侵染的存活机制，这一工作开创了研究植物抗病和细胞死亡的新方向，多个杂志对该工作发表了专评。
2）俞立教授第一次在分子水平上证明了细胞自噬也可以作为一种细胞死亡机制（Yuetal,Science，2004）并提出了一种细胞自噬性细胞死亡可能的分子机制（Yuetal,PNAS，2006）。
俞立教授还发现并描述了细胞自噬在结束期的细胞生物学过程和分子机制（Yuetal,Nature,inpress）。
3）张宏研究员实验室发现线虫的性别因子（p-granule）在发育中的降解由细胞自噬介导（Zhangetal,Cell,2009）,并以此为基础利用线虫为模型进行细胞自噬基因的全基因组筛选和部分基因的功能分析（Tianetal,Cell,inpress）。
4）杨崇林研究员实验室发现了介导自噬体与溶酶体融合的HOPS复合体在凋亡细胞的清除过程中起着不可或缺的作用（Xiaoetal.,MBC,2009），并发现retromer在细胞吞噬中重要作用（Chenetal.,Science,2010）.
5）谢志平副教授发现了自噬体的大小由Atg8的表达量控制（Xieetal,MBC,2008）。
6）马大龙教授领导的课题组在人类功能基因组的研究中，建立了人类细胞自噬新分子的细胞芯片筛选平台以及检测系统，鉴定了三个人类细胞自噬相关新分子，分别是TMEM166（Wangetal,Apoptosis,2007）,TMEM74（Yuetal,BBRC,2008）,TM9SF1（Heetal,Autophagy,2009）。
7）课题组主要成员在国际细胞自噬领域内受到认可,撰写了多篇有影响力的综述如：
Xieetal,“Naturecellbiology,”YuLetal,“Autophagy”,ZhangHetal,“Autophagy”）并应邀在该领域内主要会议上做报告（Zhang,5thinternationalsymposiumforautophagy,2009;Yu,5thinternationalsymposiumforautophagy,2009,Yu,2010GordonResearchConference）。
2.参加项目的各个课题组，拥有一系列检测不同模式生物细胞自噬系统的有关技术平台，技术成熟，经验丰富，为开展本项目提供了强有力的技术支撑。
如：
建立以反向转染为核心的RNAi芯片技术体系，目前已利用这一体系从中筛选出包括VPS28,VPS41，COPZA1等9个调控细胞自噬不同步骤的新分子，完成了近400个基因的筛选工作。
建立了以酵母双杂交为核心的细胞自噬蛋白蛋白相互作用鉴定体系；建立了多种植物细胞自噬的测定系统及在植物抗病反应中细胞自噬作用的评价体系，目前已通过这一体系鉴定出BIP1和BIP2两个细胞自噬的负调控基因。
建立了以Lgg1和P-granule为筛选标记的线虫细胞自噬基因筛选系统，并成功筛选出epg1-12等一系列细胞自噬相关分子；建立了人类细胞自噬分子的细胞芯片筛选平台以及细胞自噬检测系统，鉴定了TMEM166、TMEM74、TM9SF1等细胞自噬相关分子。
从功能研究方面，建立了包括蛋白表达纯化、抗体制备、高速显微成像、超高清显微成像、蛋白-蛋白相互作用分析、小鼠成瘤模型等一系列生化、细胞、疾病的研究手段和模型。
3.学术梯队结构合理，各研究组都有各自的研究特点，并在所用模式生物、研究手段和所关注的问题上构成了一个彼此互补、相互关联的研究队伍，为联合研究细胞自噬创造了得天独厚的条件。
4.本项目依托清华大学、北京大学、中科院遗传所、北京生命科学研究所、浙江大学和南开大学，在实验所需的公共平台和大型仪器方面都能得到很好的保障，完全可以保证本申请的实验需要。
总之，本项目依靠创新的学术思想、严密的课题设计、优秀的研究团队和良好的研究条件，综合开展蛋白质降解领域的基础研究，重点揭示细胞自噬的分子机制以及其在细胞器生成、回收，动植物个体发育，病原-寄主相互作用，以及与人类重大疾病的相关性，所获得的研究结果将为细胞自噬相关疾病的治疗和药物开发、农作物产量和品质的提高奠定源头创新的基础。
此外，本项目的实施也将大大提升我国在细胞自噬领域基础研究与开发的自主创新能力。
五、课题设置各课题间相互关系
细胞自噬是一个进化保守的基本生命过程，各模式系统的研究可以相互借鉴、相互支持。
不同模式生物具有各自的优势和特点，例如，植物的遗传学研究手段比较完备，又同农业生产等密切相关，在筛选新基因的过程中有一定优势，同时研究成果又有可能较快地转换到生产中，其缺点是其研究周期较长。
而线虫具有强大的遗传学手段，同时作为多细胞动物，其筛选结果可直接在个体水平上进行生理、发育等方面的观察，但其缺点是进行分子、细胞水平上的分析比较困难。
哺乳动物培养细胞则可进行详尽的生化、细胞学的分析，RNAi技术的发展也使大规模的基因筛选成为可能，但研究结果仅是细胞水平而非个体水平的结果。
我们的课题设置试图整合我国的不同模式生物的优势学科和优势实验室，发挥各系统的优势，弥补其不足，力争快速取得一批具有源头创新的重大成果，提升我国细胞自噬的研究水平和国际竞争力。
本项目设置4个有机联系的课题，4个课题以细胞自噬为主线，研究其分子机制和功能，不同课题各有侧重，利用细胞自噬进化保守的特点，充分发挥不同模式生物的独特优势，技术上优势互补，取得的结果相互借鉴，课题间相互支持，紧紧围绕关键科学问题，共同做好研究。
课题1：
细胞自噬的分子细胞生物学机制
主要研究内容和目标：
我们将在哺乳动物全基因组范围内进行高通量细胞自噬新基因的筛选、研究新细胞自噬蛋白的定位、转运、修饰、同已知细胞自噬功能蛋白的关系等。
重点研究自噬体膜的来源，以及自噬性溶酶体再生的分子机制等细胞自噬领域的关键问题。
预期可以筛选和鉴定出一系列参与调节细胞自噬各步骤的蛋白分子，确定这些蛋白的细胞内定位及在细胞自噬过程中的定位变化，鉴定出这些蛋白分子的翻译后修饰方式和水平，弄清这些修饰作用的生化学意义。
发现这些蛋白与已知细胞自噬蛋白之间的相互作用，明确其相互关系；阐明这些蛋白在细胞自噬中的重要作用，并将其功能定位到具体的细胞自噬发生和发展的阶段和步骤，揭示细胞自噬新的分子机制。
本课题五年内预计在影响因子大于5的SCI刊物上发表12－15篇、在国际高水平杂志（影响因子大于15）上发表论文1－2篇，力争在国际顶尖杂志Cell,Nature或Science上发表论文。
经费比例：
24.6%
承担单位：
浙江大学、清华大学
课题负责人：
刘伟
学术骨干：
俞立29
课题2：
细胞自噬在动物个体发育中的功能研究
主要研究内容和目标：
以秀丽线虫为模式，通过遗传突变可以筛选体细胞中P颗粒不能被降解的突变体，并利用图位克隆方法来克隆新的细胞自噬分子的基因，进而综合运用遗传学、细胞生物学和生物化学等研究手段阐明这些新基因在细胞自噬系统中的分子机制以及它们对个体发育的调控机制，并为哺乳动物细胞中相关基因的研究提供线索。
预期可以在国际高水平学术期刊上发表文章12-15篇，力争在国际顶尖杂志Cell,Nature或Science上发表论文，并申报专利1-2项，培养国家杰出青年基金获得者1-2名。
经费比例：
24.6%
承担单位：
中国科学院遗传与发育生物学研究所、北京生命科学研究所
课题负责人：
杨崇林
学术骨干：
张宏
课题3：
细胞自噬在肿瘤和自身免疫病中的作用
主要研究内容和目标：
对其他课题组从不同模式生物中筛选出的新的细胞自噬分子，进行人类同源分子的系统性功能分析；或者利用建立的人类细胞自噬新基因的细胞芯片筛选平台和细胞自噬的检测体系，鉴定人类新的自噬相关新分子，利用各种分子细胞生物学技术、生物芯片、基因敲除和转基因鼠、各种疾病动物模型等，阐明自噬新分子结构、效应机制和信号转导通路，研究这些细胞自噬新分子的抗肿瘤效应，了解细胞自噬新分子与人类肿瘤以及自身免疫病的相关性，阐明自噬基因的突变体与疾病的易感性，确定潜在药物靶标和新的生物标记物，为进一步的应用研究奠定基础。
预期五年内可以发表SCI论文15篇，申报中国发明专利3项，争取2项国际专利。
培养博士和硕士研究生10名以上。
经费比例：
21%
承担单位：
北京大学
课题负责人：
陈英玉
学术骨干：
马大龙赵颖
课题4：
细胞自噬在植物发育、病原-寄主相互作用中的功能研究（首席科学家所在课题组）
主要研究内容和目标：
综合运用遗传学、细胞学、生物化学手段研究细胞自噬的分子机制及其在植物对抗病原入侵及其伴随的程序性细胞死亡、在植物发育中的作用。
已烟草植物为模式，分离鉴定与细胞自噬相互作用的植物蛋白的基因，研究这些基因如何调控植物细胞自噬、如何调控植物发育和植物对抗病原入侵及其伴随的程序性细胞死亡，研究这些蛋白基因的表达及亚细胞定位对植物病原侵染的反应，了解这些互作蛋白基因如何调控细胞自噬，了解细胞自噬调控植物对抗病原入侵及其伴随的程序性细胞死亡和植物发育的作用及机制。
本课题五年内预计发表SCI论文7-10篇，包括在植物学专业最好的杂志或更好的综合性杂志发表论文2-3篇，力争在国际顶尖杂志Cell,Nature或Science上发表论文，培养博士后和研究生5名以上。
经费比例：
29.8%
承担单位：
清华大学、南开大学
课题负责人：
刘玉乐
学术骨干：
谢志平
四、年度计划
第一年
在多种模式生物中进行细胞自噬新基因的筛选，研究新的自噬基因产物的亚细胞定位，及其在自噬进程中的定位变化。
开始新自噬基因基因敲除小鼠和转基因小鼠的制备。
完成蛋白分泌通路对自噬的调控作用研究；明确高尔基体在自噬体形成中的重要作用。
预期可以筛选超过10个细胞自噬新基因或细胞自噬突变体，发表影响因子大于5的SCI论文2－4篇。
第二年
弄清自噬相关蛋白的表达和细胞内定位变化对自噬的影响，研究自噬相关蛋白的翻译后修饰加工种类和水平，明确部分自噬相关蛋白磷酸化、甲基化或乙酰化的细胞学意义，特别是在自噬调控中的意义。
明确部分自噬相关蛋白间的相互作用关系，包括它们在自噬信号通路中的上下游关系，和它们在自噬体膜形成中的前后关系。
揭示2-3个epg基因影响自噬的作用机制，阐明sorf-1基因负调控胞内体、溶酶体发生及其对自噬的影响。
了解自噬新分子发挥抗肿瘤作用的分子机制以及信号转导通路，评价它们作为抗肿瘤药物靶标、重组蛋白质药物以及抗肿瘤基因治疗或辅助治疗的潜在可能性。
发表影响因子大于5的SCI论文6－9篇。
第三年
鉴定出参与表达和定位变化调控的蛋白。
确定参与自噬相关蛋白翻译后修饰加工的激酶/磷酸酶、甲基化酶/脱甲基酶、乙酰化酶/脱乙酰化酶；明确它们的调控机制，部分阐明自噬相关蛋白的表达和活性变化对自噬的调控作用和机理。
阐明另外2-3个epg基因在细胞自噬过程中的作用机制；阐明sorf-2,-3基因调控溶酶体发生、凋亡细胞降解、及细胞自噬的作用机制。
了解自噬新分子在免疫细胞发育、增殖、分化中的的作用，分子机制以及信号转导通路。
在动物水平阐明自噬新分子在自身免疫病中的效应。
评价它们作为药物靶标的潜在可能性。
通过RNAi技术在整株植物上抑制相应基因的表达或通过植物转基因技术过表达相应基因，结合共聚焦显微成像及电子显微镜等手段了解这些互作蛋白基因如何调控细胞自噬，确定新蛋白在细胞自噬中的作用，初步了解已知细胞自噬调控网络对这些新蛋白的表达、定位和修饰的影响。
发表10-15篇论文，其中影响因子大于10的1－2篇。
申请1-2项发明专利。
第四年
进一步确定自噬相关蛋白对自噬进程的调控机理，明确自噬体膜形成、自噬体－溶酶体融合，以及自噬后溶酶体膜的转归过程；建立细胞外蛋白上膜和从膜上分离以及膜融合分析系统；建立相关转基因或基因敲除动物模型，阐明线虫的哺乳动物细胞同源因子在细胞自噬、溶酶体发生、凋亡细胞降解过程中的作用机制。
阐明自噬新分子的表达异常与肿瘤和自身免疫病发生发展的关系，以及与病情、预后的相关性，评价他们作为生物标记物的潜在的可能性。
系统的通过分子生物学、植物病理学手段和植物学解剖技术和形态观察等手段研究这些互作蛋白基因在植物对抗病原入侵及其伴随的程序性细胞死亡中的作用和在植物发育中的作用，并在亚细胞、蛋白水平上揭示新蛋白的在细胞自噬过程中的作用机理，在植物抗病和在植物发育中的作用，进一步阐明新蛋白的作用机理，发表12-15篇论文，申请1-2项中国发明专利。
第五年
进一步明确自噬相关基因产物的功能和发挥功能的分子机制，阐明自噬相关基因参与重要疾病发生和发展的机理；揭示细胞内吞、凋亡细胞吞噬与细胞自噬的交互调控机制。
进一步阐明自噬新分子的突变体对肿瘤和自身免疫病发生发展的影响，为进一步的临床应用奠定基础；确定参与到自噬过程中的重要乙酰化酶类和去乙酰化酶类；确定乙酰化修饰底物在自噬中发挥作用的具体机制。
进一步研究自噬新蛋白在特定植物发育和病原侵染或植物抗性反应中的表达调控、亚细胞定位变化和翻译后修饰，探索在相应条件下上游信号网络对新蛋白和细胞自噬的调控作用，从整体水平上揭示在植物抗病和植物发育过程中，上游信号网络对细胞自噬的调控和新鉴定蛋白在这一过程中的作用。
累计发表超过影响因子大于5的论文50篇，其中影响因子大于10的论文4-6篇，力争在Cell,Nature或Science上发表论文，培养国家杰出青年基金获得者2-3名，长江学者1-2名。
一、研究内容
本项目重点围绕细胞自噬的信号调控和分子机制和细胞自噬在生理活动中的功能及其在人类重大疾病中的作用2个关键科学问题，系统开展以下研究
（1）开展细胞自噬的分子细胞生物学机制研究，细胞自噬的细胞生物学模型可以概括为前自噬体的装配、自噬体膜的延伸、自噬体的形成、自噬体同溶酶体的融合、细胞自噬底物的降解以及我们最近发现的自噬溶酶体再生等6个步骤，目前只有32个细胞自噬相关分子被鉴定出来，这些分子主要参与和调控自噬体膜的延伸、自噬体的形成，而细胞自噬的其它步骤的分子机制了解甚少。
我们将在哺乳动物全基因组范围内进行高通量细胞自噬新基因的筛选、研究新细胞自噬蛋白的定位、转运、修饰、同已知细胞自噬功能蛋白的关系等。
重点研究自噬体膜的来源，以及自噬性溶酶体再生的分子机制等细胞自噬领域的关键问题。
（2）开展细胞自噬在动物个体发育中的功能研究，在秀丽线虫中，体细胞中的P颗粒通过细胞自噬作用而被降解。
这一发现为利用正、反向遗传学手段来发现细胞自噬通路中的新组分提供了独特的模式系统。
通过遗传突变可以筛选体细胞中P颗粒不能被降解的突变体并利用图位克隆方法来克隆相关基因，进而综合运用遗传学、细胞生物学和生物化学等研究手段阐明这些新基因在细胞自噬系统中的分子机制以及它们对个体发育的调控机制。
（3）开展细胞自噬在肿瘤和自身免疫病中的作用的研究，对从不同模式生物中筛选出的新的细胞自噬分子，进行人类同源分子的功能分析，利用各种肿瘤细胞系和裸鼠模型，研究新细胞自噬分子与肿瘤细胞生物学行为之间的联系，制备细胞自噬新基因的转基因或基因敲除小鼠，从正反两个方面分析细胞自噬新基因在肿瘤发生发展中的作用以及分子机制；分析细胞自噬分子对淋巴细胞发育、外周淋巴细胞活化、增殖等的影响，以及免疫分子对细胞自噬调节等，了解信号转导通路和分子机制，利用现有的疾病动物模型分析细胞自噬新基因的功能，利用临床标本，检测常见肿瘤和免疫病病人病变部位、外周淋巴细胞以及亚型中细胞自噬新基因的表达，分析其表达水平与病程的相关性，同时筛选细胞自噬新基因的突变体，为细胞自噬分子的疾病关联研究及临床应用提供基础。
从而从动物模型到临床病例，全面阐述人类新细胞自噬分子在肿瘤以及自身免疫中的重要作用，确定潜在药物靶标和新的生物标记物，为进一步的应用研究奠定基础。
（4）开展细胞自噬在植物发育、病原-寄主相互作用中的功能研究，分离鉴定与已知细胞自噬蛋白相互作用的蛋白的基因，研究这些基因如何调控细胞自噬以及它们如何调控植物对病原入侵的反应及植物发育。
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