多糖结构分析.docx
《多糖结构分析.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《多糖结构分析.docx(15页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
多糖结构分析
实验八多糖结构分析
多糖在生物学上的重要意义,尤其是在医药学上的重要意义决定了多糖研究的迅速发展,多糖构效关系的研究已成为多糖研究的热点。
但由于多糖结构的复杂性和多样性,其结构测定远远落后于蛋白质和核酸,本实验选择天然多糖(半乳葡萄甘露聚糖)作为实验材料,对其一级结构做初步的分析。
多糖一级结构的分析包括:
纯度鉴定,分子量测定,单糖组成测定和糖链的序列测定。
糖链的序列测定包括:
单糖残基在糖链中的次序,单糖残基间连键的位置,链的分支情况等诸多方面。
【实验目的】
1.了解多糖结构分析的内容及方法。
2.了解多糖一级结构分析的基本原理。
3.掌握多糖一级结构分析的基本方法。
一、糖含量测定
【实验原理】
苯酚—硫酸试剂与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应,己糖在490nm处有最大吸收,吸收值与糖含量呈线性关系。
【实验材料】
1.实验器材
721型分光光度计。
2.实验试剂
(1)98%的浓硫酸。
(2)80%苯酚:
80g苯酚加20ml水使之溶解,可置冰箱中避光长期贮存。
(3)6%苯酚:
临用前用80%苯酚配制。
(4)标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml):
取100mg葡萄糖,用蒸馏水溶解,定容至1L。
(5)多糖样品:
半乳葡萄甘露聚糖溶液(0.1mg/ml)。
【实验操作】
1.制作标准曲线:
取9支干燥试管,按下表操作
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
标准溶液(ml)
0
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
蒸馏水(ml)
2.0
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
6%苯酚(ml)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
浓硫酸(ml)
5
5
5
5
5
5
5
5
5
静止10分钟,摇匀,室温放置20分钟
A490
横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,绘制标准曲线。
2.样品含量测定:
取样品液1.0ml,按上述步骤操作,测光密度。
3.计算:
糖含量(%)=C/(C0×V)×100%
C:
由标准曲线查得的糖微克数
C0:
样品溶液的浓度(0.1mg/ml)
V:
测定时用的样品溶液体积(1.0ml)
二、单糖组成分析
【实验原理】
多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖,通过纸层析分离,特定试剂显色后与已知糖的标准混合物作对比,可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。
【实验材料】
1.实验器材
水解管;滤纸;玻璃毛细管;层析缸;喷雾器。
2.实验试剂
⑴标准糖溶液:
称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖,用蒸馏水溶解,得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20微克~30微克)。
⑵展层剂:
正丁醇:
乙酸:
水=4:
l:
5(上层)。
⑶显色剂:
苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液(邻苯二甲酸1.6g溶于水饱和的正丁醇100ml,加苯胺0.93g(相当于0.9ml)。
⑷BaCO3;1mol/L硫酸。
【实验操作】
l.完全酸水解:
称取20mg多糖样品,加入1mol/LH2S042ml;封管,l00℃水解8小时,然后加入BaC03中和,定量滤纸过滤,滤液留作分析。
2.纸层析:
将层析滤纸剪成7cm×40cm的纸条,距层析滤纸一端2cm处画一横线作为点样线,在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。
用玻璃毛细管点样,斑点尽可能小,而且每点一滴,待点样点干燥后,在同一位置再点第二滴。
然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析,展层时间约为36小时。
3.显色:
将滤纸取出,自然干燥,喷上苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液,100℃条件下15分钟即可显色。
标准单糖混合物色斑在滤纸上由下而上的顺序是:
半乳糖-葡萄糖-甘露糖-阿拉伯糖。
与标准单糖混合物色斑比较,即可判断多糖样品的单糖组成。
三、糖链的序列测定
(一)高碘酸氧化
【实验原理】
高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处,生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。
反应定量地进行,每开裂—个C-C键消耗一分子高碘酸。
通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量,可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类型、多糖的分枝数目和取代情况等。
【实验材料】
1.实验器材
紫外分光光度计。
2.实验试剂
(1)溴甲酚蓝指示剂:
0.1克溴甲酚蓝溶于250ml蒸馏水中(含1.43毫升0.1mol/L氢氧化钠)。
(2)30mmol/L高碘酸钠溶液。
(3)乙二醇。
(4)0.01mol/L氢氧化钠溶液。
【实验操作】
1.制作标准曲线:
取6支干燥试管,按下表操作
管号
0
1
2
3
4
5
高碘酸钠(ml)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
4.0
蒸馏水(ml)
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
0
各取0.1ml,定容至25ml,在223nm处测定光密度
A223
横坐标为高碘酸钠毫摩尔数,纵坐标为光密度值,绘制标准曲线。
2.样品测定
称取多糖样品25mg,用少量水溶解,加入30mmol/L高碘酸钠溶液,定容至25ml,置于暗处,室温下进行反应,于0,6,12,24,36,48…小时间隔取样0.1ml,蒸馏水稀释250倍后,使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。
至光密度值达一稳定值时,加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。
由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量。
取2ml上述反应溶液,测定甲酸的生成量。
剩余部分进行Smith降解。
3.甲酸测定:
取2ml上述反应溶液,加一滴溴甲酚蓝作指示剂,用0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸的释放量。
【注意事项】
为避免发生超氧化,反应溶液的pH值应控制在3~5,而且一定要在低温、避光处进行。
(二)Smith降解
【实验原理】
Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物(如硼氢化钾或硼氢化钠)还原成稳定的多羟基化合物,然后进行适度的酸水解,用纸层析鉴定水解产物,由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。
以葡聚糖为例,其反应式如下图:
以1→2位键合的糖基经高碘酸氧化,平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸,并且无甲酸释放;Smith降解后产生甘油。
以1→4位键合的糖基经高碘酸氧化,平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸,并且无甲酸释放;Smith降解后产生赤藓醇。
以1→3位键和的糖基不被高碘酸氧化;Smith降解后仍为原来糖。
以1→6位键和的糖基或非还原末端基(1→)经高碘酸氧化,消耗二分子高碘酸,同时释放一分子甲酸
;Smith降解后产生甘油。
本实验通过纸层析检测终产物中的甘油、赤藓醇和糖。
【实验材料】
0.1mol/L醋酸。
2mol/L硫酸。
硼氢化钾。
纸层析试剂及器材:
除显色剂外,同实验二。
硝酸银显色剂:
A:
16%硝酸银水溶液:
丙酮为1:
9(V/V)。
B:
1%NaOH乙醇溶液(W/V)。
C:
6mol/L氢氧化铵。
【实验操作】
1.还原和水解
高碘酸氧化后经乙二醇处理的溶液对流水透析48小时,蒸馏水透析24小时,于40℃以下减压浓缩至10ml左右,加入70mg硼氢化钾于室温、暗处搅拌18小时~24小时以还原多糖醛。
用0.1mol/L醋酸中和至pH6~7,对流水透析48小时,蒸馏水透析24小时,减压蒸干,加1mol/L硫酸2ml,封管,100℃水解8小时,用碳酸钡粉末中和,定量滤纸过滤,滤液减压浓缩后,通过纸层析方法检测。
2.纸层析
操作详见实验2(单糖组成分析)。
展层后,将滤纸取出,自然干燥,喷上试剂A,自然干燥,将滤纸浸入试剂B中,待斑点显出后,再浸入试剂C中以洗去滤纸上的氧化银,然后用水冲洗1小时左右,风干。
以正丁醇:
乙酸:
水=4:
l:
5为展层剂时,甘油的Rf为:
0.48,赤藓醇的Rf为:
0.35。
【思考题】
1.多糖一级结构的分析包括哪些内容?
2.如果多糖经高碘酸氧化和Smith降解,发现产生的甘油量等于产生的甲酸量,说明该多糖主要含哪一种糖甘键,为什么?
半乳葡萄甘露聚糖的一级结构通式:
Experiment20StructureAnalysisofPolysaccharide
Thesignificanceofpolysaccharideinbiologyrealm,particularlyinMedicalscienceandpharmaceuticalrealm,leadstothequickdevelopmentofresearchonpolysaccharide.Researchontherelationshipbetweenpolysaccharidestructureandfunctionhasbecomeanotherhotpointinpolysaccharideresearch.Structureanalysisofpolysaccharidegetsbehindclearlythestructureanalysisofproteinandnucleicacidsduetothediversityofpolysaccharidestructure.Methodsusedcurrentlyforstructureanalysisofpolysaccharideincludechemicalmethods,zymologicalmethodsandinstrumentsmeasuremethods.Weanalyzeessentiallytheprimarystructureofnaturalpolysaccharide(Galactogluco-mannan)inthisexperiment;theprimarystructureanalysisofpolysaccharideincludespuritydetermination,molecularweightdetermination,andcompositionofmonosaccharidedeterminationandsequenceofpolysaccharidedetermination.Thesequenceofpolysaccharidedeterminationincludesanalysisoforderofmonosaccharideinpolysaccharidemolecule,thedegreeofbranchingofpolysaccharidemolecule,thepositionandnatureofglycosidicbondsandsoon.
【Purpose】
1.Understandthecontentandmethodonstructureanalysisofpolysaccharide.
2.Understandthebasicprincipleontheprimarystructureanalysisofpolysaccharide.
3.Masterthebasicmethodsusedforprimarystructureanalysisofpolysaccharide.
Ⅰ.ContentDeterminationofPolysaccharide
【Principle】
Phenol-sulfuricacidreagentscanreactwithfreehexose,alduronicacidorhexose,alduronicacidofoligosaccharideandpolysaccharide.Afterthereaction,thesolutionhasthemaximumabsorptionat490nm(hexose),atwhichtherelationshipbetweenabsorbanceandthecontentofpolysaccharidetakesonlinearityindefiniterange.
【Materials】
1.Apparatus
721Spectrophotometer.
2.Reagents
(1)98%concentratedsulfuricacid.
(2)80%phenol:
Dissolve80gofphenolinto20mlwater,thesolutioncanbestockpiledinthedarkinrefrigeratorforalongtime.
(3)6%phenol:
dilutewith80%phenolonthedayneeded.
(4)Standardglucosesolution(0.1mg/ml):
Dissolve100mgofglucose,anddiluteitto1Lwithdistilledwater.
(5)Polysaccharidesolution:
Galactogluco-mannansolution(0.1mg/ml).
【Procedures】
1.Drawstandardcurve:
Prepare9drytesttubesandoperateasthetablebelow
TubeNo.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
standardsolution(ml)
0
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Distilledsolution(ml)
2
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
6%phenol(ml)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Concentratedsulfuricacid(ml)
5
5
5
5
5
5
5
5
5
PlaceStaticallyfor10minutes,shakeevenlyandplaceatroomtemperaturefor20minutes.
A490
Wecandrawthestandardcurveaccordingtotheresultofdetermination.
Abscissa:
contentofpolysaccharide(μg)
Ordinate:
thevalueofopticaldensity
2.Determinationofsaccharidecontentinsamplesolution:
Draw1.0mlofpolysaccharidesamplesolution,andperformasdescribedabove.Thesaccharidecontentinthesamplecanbelookedupfromthestandardcurvebytheabsorbencymeasured.
3.Calculation:
Saccharidecontent%=C/(C0×V)×100%
C:
saccharidecontentlookedupfromstandardcurve(μg)
C0:
sampleconcentration(0.1mg/ml)
V:
samplevolumeusedfordetermination(1.0ml)
Ⅱ.CompositionofMonosaccharideDetermination
【Principle】
Polysaccharidecanbecompletelyhydrolysedatdefinitetemperatureinconcentratedsulfuricacidforenoughtime.Separatethehydrolysatebypaperchromatography,theseparatedmonosaccharidecanformcoloredcompoundwithdefinitechromogenicreagent,Comparewithstandardsaccharidecolorspots,compositionofmonosaccharideinpolysaccharidehydrolysatecanbedetermined.
【Materials】
1.Apparatus
Ampoule,Filterpaper,Glasscapillaries,Chromatographytank,Vaporization.
2.Reagents
(1)Standardsaccharidesolution:
Weightrespectivelycertainamountofeachsaccharidesamplebelow:
galactose,glucose,mannoseandarabinose.Thendissolvethemindistilledwatertopreparestandardsaccharidemixture.(20μg~30μgofeachspottedonthefilterpaper)
(2)Developreagent:
1-butanol:
aceticacid:
water=4:
l:
5(upperphase).
(3)Chromogenicreagent:
Watersaturationsolutionofanilin-phthalicacid-1-butanol.Dissolve1.6gphthalicacidofin100mlWatersaturationsolutionof1-butanol,thenadd0.93gof(equalto0.9ml)anilintothesolution.
(4)BaCO3;1mol/LH2S04.
【Procedures】
1.Completeacidhydrolysis:
Weight20mgofthepolysaccharidesample,add2mlof1mol/LH2S04inanampouleandsealit,hydrolyzeat100°Cfor8h.NeutralizedwithBaC03,filterandcollectthefiltratetoanalyzesugaranalysis.
2.Paperchromatography:
Cutchromatographyfilterpaperinto7cm×40cmpieces.Drawalineasspottingend2cmneartheedge.DrawtwospotsonthelineasspottinglocationofStandardsaccharidesolutionandhydrolysaterespectively.Spotthesolutiononthefilterpaperwithglasscapillary;thespotshouldbeassmallaspossible.Drythespotintheairandthenspotthesamesolutionagainatthesamelocation.Hangthefilterpaperinsidechromatographytankanddevelopfor36h,pickoutthepaperanddryintheair.SprayWatersaturationsolutionofanilin-phthalic-n-butanolonthefilterpaper.Dry15minat100℃tomakethecolorspotemerges.Theupwardsequenceofstandardmonosaccharidesamplespotis:
galactose-glucose-mannose-arabinose.Comparewithstandardsaccharidecolorspots,samplecompositioncanbedetermined.
Ⅲ.SequenceofPolysaccharideDetermination
1.PeriodateOxidation
【Principle】
Periodateoxidationinvolvesthesimultaneousoxidationandcleavageofcarbontocarbonbondsthathaveadjacentfreehydroxylgroupsinsaccharides,theproductsofperiodateoxidationincludehomologousaldehydeofpolysaccharide,formaldehydeorformate,thecleavageofonemoleculeofcarbontocarbonbondsconsumesonemoleculeofperiodateinthereaction.Informationaboutthestructureofpolysaccharides,suchasthedegreeofbranching,andthepositionandnatureofglycosidicbondsandofnon-carbohydrateresiduesinpolysaccharidescanberevealedbye