免疫基础知识.docx
《免疫基础知识.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫基础知识.docx（24页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
免疫基础知识
免疫基础知识
一、免疫基本理论知识
ELISA是一种免疫测定。
免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。
在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。
1.1 抗原
抗原（antigen,Ag）是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答的产物（抗体或效应细胞）发生特异性结合的物质。
抗原具有免疫原性和反应原性两种性质。
免疫原性是指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应。
反应原性是指产生的抗体或致敏T淋巴细胞能与抗原进行特异性结合的免疫反应。
抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenicdeterminant），或称为表位（epitope）。
一个抗原分子可带有不同的决定簇。
既具免疫原性又具反应原性的抗原称免疫原。
某种物质之所以能成为一个良好的免疫原，是因为它有特异的化学结构，这就是抗原决定簇。
抗原决定簇可以与相应的淋巴细胞表面的受体蛋白结合引起免疫应答。
一个抗原决定簇只能激活一种淋巴细胞（对于B细胞）只刺激产生一种类型抗体。
一个抗原可以有一个或多个抗原决定簇。
抗原功能性决定簇的总数称抗原结合价。
抗原决定簇少，抗体与抗原结合就少，往往就见不到反应。
天然抗原或复杂的半抗原的决定簇往往多达几十个，因此可以与很多抗体分子交互结合。
有些分子本身没有免疫原性，不能引起免疫反应，但是如果把它们和某些载体分子，如蛋白质分子结合起来就有了免疫原性，就能使动物对这一复合分子产生特异的抗体。
这种本身无免疫原性，但有反应原性，一旦把它与载体结合就有了免疫原性的物质，就称半抗原或不完全抗原。
如寡糖，类脂和一些简单的化学物质等。
吗啡就是一种半抗原，把它与蛋白分子结合起来，就可以使动物体产生相应抗体，此抗体可作为检测是否吸毒的试剂。
分子量大者免疫原性强。
抗原可分外源性抗原和内源性抗原两类，前者如细菌、病毒、花粉、各种毒素以及小型动植物；后者主要为机体从未接触过的物质或构象发生改变的自身成分，如变性的IgG重链、晶状体物质、精子、脑组织等。
1.2 抗体
1.2.1抗体的产生
免疫系统受抗原刺激后，B细胞转化为浆细胞，由浆细胞产生与抗原发生特异性结合的球蛋白，这类球蛋白称为抗体（antibody,Ab）。
免疫球蛋白（immunoglobulim,Ig）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。
免疫球蛋白普遍存在于哺乳动物和人类的血液、组织液和外分泌物中。
人体的免疫球蛋白主要有五类：
IgM、IgA、IgG、IgD、IgE。
从结构来看，IgA有单体、双体、三体及多聚体之分。
分泌液中IgA（SIgA）是双体.按其免疫功能又分为血清型及分泌型两种,IgA不能通过胎盘。
新生儿血清中无IgA抗体，但可从母乳中获得分泌型IgA.IgG、IgD、IgE为单体。
IgM是五聚体。
1.2.2抗体的结构
与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。
IgM是抗原刺激诱导体液免疫应答中最先产生的Ig，IgG在机体合成要晚于IgM，它是唯一能通过胎盘的Ig。
Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。
Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。
五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。
IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。
IgG的结构见图。
IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。
每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。
另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。
IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。
IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。
IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000。
机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。
经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。
IgM抗体一般为保护性抗体，具有免疫性。
因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。
1.2.3单克隆抗体的产生
机体受抗原刺激后，B淋巴细胞产生相应的抗体。
含有抗体的血清称为抗血清（antiserum）。
每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。
如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体，则将由多系的B细胞产生相应的多种抗体，这些抗体均存在于免疫血清中。
免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。
产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。
将单个杂交瘤细胞分离，在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb或Mab）。
单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇，具有很高的特异性。
单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。
将免疫的脾细胞（含产生抗体的B细胞）与小鼠肿瘤细胞融合，分离杂交瘤细胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。
1.3 抗原抗体反应
1.3.1可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·Ab。
.抗体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，可以平衡常数K表示：
K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]。
Ag·Ab的解离程度与K值有关。
高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。
解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。
在抗血清中，特异性的IgG抗体仅占总IgG中的极小部分。
用亲和层析法提取的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。
1.3.2最适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图1-4。
曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zoneofequivalence）。
在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。
如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zonephenomenon）。
抗体过量称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。
在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。
1.3.3特异性
抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。
由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。
例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），虽来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。
抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
但是这种特异性也不是绝对的。
假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交叉反应。
例如：
绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。
用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH发生交叉反应。
在临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。
因此在作为早孕诊断（敏感度应达到50mIu/mlhCG）的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。
1.3.4 敏感性
在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。
标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。
例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
1.4 影响抗原抗体反应的因素
1.4.1电解质
抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。
为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85％氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。
由于氯化钠在水溶液中解离成na+和c1－，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降。
当电势降至临界电势（12～15mv）以下时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。
1.4.2酸碱度
抗原抗体反应必须在合适的ph环境中进行。
蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。
抗原抗体反应一般在ph为6～8进行。
ph过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如ph达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。
1.4.3温度
在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。
但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在40℃时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。
常用的抗原抗体反应温度为37℃。
每种试验都有其独特的最适反应温度，例如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。
1.4.4震荡
适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应
1.1.5杂质
反应中如存在与反应无关的蛋白质，多糖等非特异性的结合物质，往往抑制反应进行甚至引起非特异性反应。
1.5免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广，在临床检验中可用于测定：
（1）体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。
（2）激素，包括小分子量的甾体激素等。
（3）抗生素和药物。
（4）病原体抗原，HBsAg、HBeAg等。
（5）另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs等。
二、免疫吸附实验基本原理
2.1基本原理
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
2.2免疫反应的类型
免疫可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；
（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于临床检验的ELISA检测原理主要有夹心法、间接法、竞争法和捕获包被法，以下为几种反应类型的具体反应原理：
2.2.1 双抗体夹心法测抗原
主要用于检测二价或二价以上的大分子，抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本，保温反应。
标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
（3）加酶标抗体，保温反应。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
（4）加底物显色。
固相上的酶催化底物成为有色产物。
通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。
如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。
类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hookeffect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。
钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。
因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和hCG）时，应注意可测范围的最高值。
用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
另外，采用稀释，或是把一步法改为两步法操作也可以减少钩状效应的产生。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。
但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。
RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。
采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。
双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2.2.2双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
2.2.3间接法测抗体
主要用于检测IgG抗体，间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清，保温反应。
血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体。
可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。
固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
（4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。
虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。
抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。
另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性IgG。
病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。
IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。
因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。
另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:
40~1:
200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
2.2.4竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。
标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
如抗原为高纯度的，可直接包被固相。
如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。
洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。
另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。
抗HBe的检测一般采用此法。
2.2.5竞争法测抗原
主要用于检测小分子抗原，小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。
标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
2.2.6捕获包被法测抗体
主要用于检测IgM抗体，IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。
间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。
如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。
因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。
在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。
捕获包被法又分为1）中和抗原捕获包被法。
先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。
然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。
继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。
再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。
2）酶标抗原捕获包被法。
先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。
然后加入酶标记的特异性抗原，，此抗原仅与特异性IgM相结合。
再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。
捕获包被法常用于病毒性感染的早期诊断。
类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。
因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMVIgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
1）中和抗原法
2）酶标抗原法
三、ELISA的试剂
3.1试剂盒组分
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。
ELISA中有三个必要的试剂：
免疫吸附剂、结合物和酶的底物。
完整的试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。
3.2固相载体
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。
可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。
作为ELISA固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。
聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
3.3结合物
结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。
良好的结合物应该是既保持有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。
结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。
此外，结合物尚要有良好的稳定性。
酶：
用于ELISA的酶应符合以下要求：
纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。
最好在受检标本中不存在相同的酶。
另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。
在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）和碱性磷酸酶（alkalinephosohatase,AP）。
在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。
国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。
在ELISA中，AP系统的敏感度一般高于HRP系统，空白值也较低，但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低。
3.4酶的底物
3.4.1HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：
DH2+H2O2D+H2O
上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。
在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。
常用的供氢体有邻苯二胺（O-
phenylenediamine,OPD）、四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB）和ABTS[2,2'-azino-di-（3-ethylbenziazobinesulfonate-6）]。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。
曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。
OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。
TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。
另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。
酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。
ABTS虽不
升级会员 