浅论人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响.docx

浅论人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响.docx

《浅论人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浅论人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响.docx（4页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

浅论人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响

浅论人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响

【摘要】　　目的探讨人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织c-junN-末端激酶表达的影响及其意义。

方法将大鼠随机分为假手术组、单纯缺血再灌注组、人参皂甙Rg110、20、40mg/kg组、尼莫地平1mg/kg组，采用大脑中动脉闭塞法建立脑缺血再灌注模型,应用免疫组织化学方法检测脑组织缺血再灌注4h后pJNK的表达。

结果人参皂甙Rg1各剂量组大鼠脑组织pJNK表达阳性率分别为（±）,（±）,（±），均低于单纯缺血再灌注组（±）。

结论人参皂甙Rg1防治大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与抑制脑组织pJNK表达有关，且以高剂量效果较好。

【关键词】人参皂甙Rg1脑缺血再灌注pJNK大鼠

　　Abstract:

ObjectiveTodiscusstheeffectsofGinsenosideRg1ontheexpressionsofJNKintheratsbraintissueafterfocalcerebralischemia-reperfusionanditssignificance.MethodsRatsweredividedintothesham-operativegroup,Modelgroup,GinsenosideRg1groupsof10mg/kg,20mg/kg,40mg/kg,andNimodipinegroupof1mg/kgatrandom.Themethodofmiddlecerebralarteryocclusion（MCAO）inratswasadoptedtoestablishthemodelofcerebralischemia-reperfusion,andthentheexpressionsofJNKaftercerebralischemia-reperfusion6hwastestedbasedonthechemicalmethodinimmunitytissue.ResultsThepositiverateofexpressionofratsbraintissueineachoftheGinsenosideRg1groupsis（±）,（±）,（±）respectively.ConclusionsTheresultsshowedthatthemechanismofGinsenosideRg1toprotectthebraincellsfromdamageaftercerebralischemia-reperfusioninjurymaybeassociatedwithJNKexpressiontoinhibitbraintissue,anditwasmoreeffectivewhenGinsenosideRg1wasinhigh-dose．

　　Keywords:

GinsenosideRg1;cerebralischemia-reperfusion;JNK；rat

　　研究表明，人参皂甙Rg1能通过抑制细胞凋亡对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用，但其抗凋亡的机制还不十分清楚［1］。

丝裂原蛋白激酶信号通路（mitogenactivatedproteinkinases，MAPKs）是脑缺血再灌注损伤中主要的信号通路，它包括5个亚家族，其中c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinases，JNKs）亚家族主要参与细胞凋亡的调控。

本实验拟采用免疫组织化学方法检测脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区神经元pJNK的表达，并观察人参皂甙Rg1对pJNK蛋白表达的影响，以明确人参皂甙Rg1是否通过JNK信号通路来抑制脑缺血再灌注后的神经元凋亡。

　　1材料与方法

　　实验动物分组与给药方法

　　Sprage-Dawl大鼠，雄性，体重为250～300g，随机分为6组：

①假手术组；②单纯缺血再灌注组；③～⑤人参皂甙Rg1给药组；尼莫地平药物对照组；每组5只大鼠。

③～⑥组分别于术前5d至取材当日腹腔注射人参皂甙Rg1、尼莫地平，其余各组分别注射等量等渗生理盐水，1次/d。

　　药品及试剂

　　人参皂甙Rg1（纯度95%）购自吉林大学有机化学教研室；尼莫地平注射液（批号为071001），购自山西亚宝药业；其它药品均为国产分析纯，由辽宁医学院科学实验中心提供。

　　大鼠右侧局灶性脑缺血（MCAO）模型的制备

　　10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉，采用改良线栓法［2］制备大鼠局灶性脑缺血模型。

线栓采用头端光滑烫圆的直径mm鱼线，长度由右侧颈外动脉分叉部计约mm。

栓塞2h后，将鱼线轻轻拔出并缝合皮下筋膜及皮肤，即为再灌注模型，再灌注时间为4h。

　　免疫组织化学染色及图像分析

　　MCAO术后6h，将各组大鼠麻醉，4%多聚甲醛灌流固定，断头取脑，梯度酒精脱水，定向石蜡包埋切片，厚5μm。

切片常规脱蜡至水，免疫组化Envision法染色：

3%过氧化氢溶液处理15min以去除内源性过氧化物酶；然后采用枸椽酸缓冲液高压修复抗原，自然冷却至室温后；滴加1∶200稀释的pJNK单克隆抗体4℃孵育过夜；然后滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体37℃孵育30min。

每步骤之间用MPBS洗3次，每次5min。

DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

阴性对照用PBS替代一抗［2］。

pJNK蛋白阳性定位于神经元的细胞核，呈棕黄色。

　　采用CIAS-1000型细胞图像分析系统进行阳性细胞计数。

每例标本等间隔选取切片3张，每张切片随机选取右侧海马CA1区2个不重叠高倍视野（400倍），计数每个视野下细胞总数及阳性细胞数量，计算表达阳性率=%［3］。

　　统计学分析

　　应用软件分析，所有数据均用±s表示。

多组间差异显着性检验采用单因素方差分析及两两比较的q检验。

　　2结果

　　pJNK蛋白免疫组织化学定性、定位表达

　　假手术组大鼠大脑右侧海马CA1区偶见神经元胞核染色；单纯缺血再灌注组可见大量阳性细胞，与假手术组比较有显着差异（）；人参皂甙各组和阳性对照药尼莫地平组能显着降低MCAO大鼠海马CA1区的pJNK阳性细胞数，与单纯缺血再灌注组比较有显着性差异（）；人参皂甙Rg110、40mg/kg组与阳性对照药尼莫地平1mg/kg组比较均有显着性差异（），其中40mg/kg组抑制pJNK表达的程度显着优于尼莫地平1mg/kg组，而人参皂甙Rg120mg/kg组与阳性对照药尼莫地平1mg/kg组无统计学差异（），见表1，图1。

　　表1各组大鼠MCAO术后6h右侧海马CA1区pJNK表达阳性率比较

　　注：

与假手术组比较，；与单纯缺血再灌注组比较，；与尼莫地平1mg/kg组比较，；与人参皂甙Rg110mg/kg组比较，；与人参皂甙Rg120mg/kg组比较，

　　3讨论

　　研究表明，脑缺血时组织低氧可使细胞发生坏死或凋亡。

JNK家族是MAPK家族成员之一，与细胞凋亡有密切联系［4］。

不论是短暂性还是永久性缺血损伤，JNK信号转导通路在神经元中都被激活，从而发挥重要的作用［5-6］。

WangZQ等利用大脑中动脉永久栓塞（MCAO）模型，证实脑缺血或缺血再灌注后损伤中心脑区JNK的激活主要在损伤后30min～6h，以神经元为主，在损伤中心区和半暗带区磷酸化的JNK显着增多［7-8］。

　　JNK主要表达于胞质内，核内也有少量表达。

JNK一旦被激活，称为pJNK，立即从细胞质移位至细胞核，并可引起级联反应，导致其一些作用底物相应激活。

首先，pJNK通过对c-Jun氨基末端63与73位的丝氨酸进行有效的磷酸化而激活c-Jun。

活化的c-Jun可以聚合成二聚体而形成可以活化的蛋白-1（AP-1）复合物，这种复合物通过与其靶DNA结合相结合激活下级基因而发挥其抗凋亡作用［9］。

　　本实验结果显示：

假手术组有少量pJNK阳性细胞；与假手术组比较，单纯缺血再灌组大鼠海马CA1区神经元可见大量pJNK阳性细胞，差异有统计学意义（），这一实验结果与以往文献报道基本一致；人参皂甙Rg1三个剂量组与单纯缺血再灌注组比较，pJNK的表达明显减少，提示人参皂甙Rg1具有抑制脑缺血再灌注大鼠pJNK的作用。

人参皂甙Rg1各组分别与阳性对照药尼莫地平组比较，人参皂甙Rg110mg/kg组虽能抑制神经元pJNK的表达，但与阳性对照药尼莫地平组比较仍显着性差异（）,而人参皂甙Rg120、40mg/kg组与阳性对照药尼莫地平组无统计学差异（），此结果提示人参皂甙Rg1中、高剂量组的效果在抑制pJNK蛋白表达方面具有与尼莫地平相似的效果。

本结果提示人参皂甙Rg1具有抑制pJNK蛋白表达的作用，但其能否通过抑制JNK信号通路减少脑缺血再灌注损伤引起的神经元凋亡，以发挥其对缺血性脑损伤的保护作用尚需进一步证实。

【参考文献】

　　［1］王海波，李源莉.人参皂甙Rg1神经保护作用的研究进展［J］.白求恩军医学院学报，2008，6：

291-293.

　　［2］张铭,司少艳,韩瑞刚，等.　免疫组化SP法与PicTureTM两步法的比较［J］.诊断病理学杂志，2004,11

（1）:

58-59.

　　［3］王凤岩,夏潮涌.组织原位肿瘤细胞DNA含量与倍体分析的某些方法学问题［J］.中华病理学杂志，2000,29（5）:

381-382.

　　［4］FarrokhniaN,RoosMW,TeréntA，etal.Differentialearlymitogen-activatedproteinkinaseactivationinhyperglycemicischemicbraininjuryintherat［J］.EurJClinInvest［J］.2005，35（7）:

457-463.

　　［5］GinetV,PuyalJ,MagninG,etal.Limitedroleofthec-JunN-terminalkinasepathwayinaneonatalratmodelofcerebralhypoxia-ischemia［J］.JNeurochem，2009,108（3）:

552-562.

　　［6］BorselloT,ClarkePG,HirtL，et　peptideinhibitorofc-JunN-terminalkinaseprotectsagainstexcitotoxicityandcerebralischemia［J］.NatMed，2003，9（9）：

1180-1186.

　　［7］RepiciM,CentenoC,TomasiS,etal.Time-courseofc-JunN-terminalkinaseactivationaftercerebralischemiaandeffectofD-JNKI1onc-Junandcaspase-3activation［J］.Neuroscience，2007,150

（1）:

40-49.

　　［8］FerrerI,FrigulsB,