辐照食品检测.docx

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辐照食品检测

辐照食品检测

自1989年IAEA组织了为期5年的辐照食品分析检测方法国际协调研究,将辐照食品检测方法国际由实验室研究推向了实际应用。

目前,TL法、ESR法以及化学法等已在国际贸易中被使用。

此外,针对食品在辐照过程中产生的独特细微的物理化学变化及生物学迹象,开展了大量分析测试研究,提出了一批有潜力的方法,如高效液相色谱检测法（HPCL）、激光成像检测法、核磁共振（NMR）及化学发光法等。

强化了有关辐照食品的国家标准,推动了食品辐照技术的研究和发展,辐照食品的检测已成为辐照技术中非常活跃的研究领域之一。

本文介绍近年来国内外食品辐照检测技术的研究进展,着重对几种综合运用生物技术和现代辐照食品分析检测技术进行了阐述,对今后食品检测技术研究和发展方向进行了探讨。

1、利用辐射化学效应检测辐照食品

1.1含脂辐照食品的检测

利用有机过氧化物检测辐照食品存在一些争议。

但对猪肉脂肪的研究发现,辐照可在猪肉脂肪中产生一些对辐照检测有意义的特性,这些特性包括:

（1）不同来源未辐照猪肉脂肪样品中,用Na2s2o3滴定法测得过氧化物的平均含量为（5.4±3.0）×10-5mol.kg-1脂肪,最大为17×10-5mol.kg-1脂肪。

在一般的冷冻贮藏条件（-18℃,空气）下,猪肉脂肪的自氧化速率很慢,贮藏约7个月,多氧化物含量基本保持不变（图1）

（2）在γ辐照条件下（样品始温度为-18℃,在空气和室温环境下辐照,样品终温约为0℃）,过氧化非常迅速,生成的过氧化物量与吸收剂量成线性关系。

2kGy辐照处理的猪肉脂肪中,产生的约为10-3mol.kg-1脂肪,约为未辐照猪肉脂肪中过氧化物平均含量的17倍,约为最大含量的5倍。

（3）辐照猪肉在冷冻贮藏（-18℃,空气）中,脂肪里的过氧化物含量随贮藏时间增加而增高,在前一个月内增加较缓慢,一个月后过氧化物浓度迅速增高（图1）。

（4）冷冻贮藏条件下,未辐照的猪肉脂肪,表面和内部过氧化物浓度几乎与贮藏时间2。

对于辐照的脂肪,其内部过氧化物浓度也不随贮藏时间变化,但表面过氧化物浓度则随贮存时间增加而增高（图2）。

根据上述性质,可以得到过氧化物方法检测辐照猪肉的判断标准。

根据未辐照猪肉脂肪中自氧化过程非常缓慢的特性,过氧化物的本底平均值（5.4±3.0）×10-5mol.kg-1脂肪,可作为判别猪肉是否已经辐照的参考值,如果样品中过氧化物浓度与此值接近,则样品可被认为是未辐照的,反之则是辐照过的。

以2kGy剂量辐照猪肉的脂肪中,辐照生成的过氧化物量为10-3mol.kg-1脂肪。

因此可合理地取（0.5+0.17）×10-3mol.kg-1脂肪作为<1kGy辐照猪肉脂肪中过氧化物含量的上限。

若取0.7×10-3mol.kg-1脂肪过氧化物作为参考值,则过氧化物方法就能正确检测≥1kGy剂量辐照的猪肉。

测定样品放置（-18℃,空气）时过氧化物含量的变化,可认为样品中过氧化物含量随放置时间而变化,可认为样品是经辐照的,反之样品是未辐照的,

0.7×10-3mol.kg-1脂肪作为参考值,对14个≥1kGy辐照的猪肉样品,盲法测试的成功率100%。

1.2含蛋白质辐照食品的检测

应用辐解产物检测辐照蛋白质食品已经进行了许多研究,其中苯丙氨酸或含苯丙氨酸的蛋白质食品辐照产生的羟基化产物——邻酪氨酸和间酪氨酸更富应用潜力。

因此在食品中这些产物的存在可被看作是食品已被辐照的标志。

辐照生成的酪氨酸异构体中,邻酪氨酸的量最大,用气相色谱技术可将其与天然的对酪氨酸分离,因此选用邻酪氨酸作为检测蛋白质食

品辐照的探针化合物。

凯罗姆（Karam）和赛密克（Simic）在未辐照鸡肉的液体中检测到了邻酪氨酸,但是水不溶的鸡肉纤维中没有找到,因此将水不溶部分用于检测。

方法简述如下:

（1）将鸡肉真空干燥,继之用水清洗获得水不溶部分（主要为肌肉纤维）。

（2）将蛋白质用6mol/LHcl在110℃酸水解24h,氨基酸用双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺衍生化（BSTFA）。

（3）用熔融石英毛细管柱分离,使用选择离子监测质谱仪检测。

在早期的工作中,他们曾在样品干燥之前用CCl4溶剂萃取脂类,但是萃取导致较高的邻酪氨酸本底。

辐照在水不溶部分生成的邻酪氨酸与吸收剂量成线性关系,当用10kGy辐照是（20℃）,邻酪氨酸的浓度为5.7±1.9mg/kg,在1kGy时,其含量为0.52mg/kg。

在10kGy20℃）辐照的整鸡（包括水溶性部分）中,形成的邻酪氨酸为11±2.6mg/kg。

这些值远超过检测极限0.05mg/kg。

梅尔（Meier）等人将这个方法改进后用于辐照鸡中邻酪氨酸的检测。

方法如下:

（1）将鸡肉样品均匀化,冷冻干燥。

（2）50mg样品用300mlH2O和600μl30%HCl（约6mol.L-1HCl）在110℃酸水解24h或在150℃酸水解1h。

（3）将水解液适当稀释后用装备荧光检测器的HPLC分离测量（色谱柱:

Hypersil-5-ODS250×4.6mm,淋洗剂:

A:

1%乙腈,1%NaCl,二次重蒸水;B:

50%乙腈,0.5%NaCl,二次重蒸水;C:

80%乙腈,1%NaCl,二次重蒸水。

梯度淋洗:

100%A:

0min-12min;100%B:

12min-17min（出去杂质）:

100%C:

17min-35min（使系统恢复）,流速:

1ml/min）。

该法的检测极限为0.01mg/kg。

他们发现,邻酪氨酸的生成与吸收剂量成正比关系,10kGy辐照的鸡肉,邻酪氨酸的含量为0.5mg/kg,未辐照的鸡肉含量一般小于0.01mg/kg。

因此邻酪氨酸含量大于0.1mg/kg的样品可被认为是辐照的。

1.3利用DNA链断裂变化检测辐照食品

电离辐射作用下,DNA很易发生链断裂,形成较小分子量碎片。

链断裂过程是由CAN碱基自由基以及部分.OH基H原子作用于DNA糖基形成的自由基引起。

但产生DNA链断裂碎片不是辐照专一的,其他如加热、反复冷冻一融解样品、以及贮藏时酶催化反应都能引起链断裂,因此检测DNA链断裂只能作为检测辐照食品的预筛选方法。

最简单的检测DNA链断裂碎片的方法是过滤法.弗来吉奥（Flegeau）[8]等人用过滤法研究了冷冻的挪威龙虾肉中DNA分子大小的变化,他们用2μm孔径的滤器将DNA截留在滤器上,用显微荧光测定法测量截留DNA量,发现用3kGy辐照的龙虾肉保留DNA量为0.21μm,比未辐照地.32μm少得多.最近此法已改进,把原来一步过滤改成二步过滤.第一步用2μm孔径的滤器将DNA阻留在滤器上,之后用一个致密的0.2μm孔径的滤器截留DNA碎片,将未断链的DNA量与DNA总量相比较,求出保留在滤器1（2μm）上的DNA与保留在滤器1和2（0.2μm）上的DNA之比.实验发现辐照样的比值为（5.8±5）%,而未辐照样为（48±11）%,两者有着明显的差异.

狄林西（Delincee）[9]在单细胞或核微凝胶电泳研究基础上,发展了一种简单、快速的DNA“彗星”检验法。

此法以电场存在时DNA在琼脂糖凝胶中的迁移为依据,被埋入琼脂糖中的单细胞或核在溶胞后,完整DNA在电脉时不会移动到细胞外面,而DNA碎片则能迁移到细胞外,在着色后出现一个肉眼可见的“彗星”状图象。

即使DNA碎片不是辐照专一的,但仍能区分辐照和未辐照的样品。

辐照细胞电脉后形成明显的“彗星”,且在辐照样品中观察不到完整的或表现完整的细胞,未辐照样品也产生“彗星”,但能观察到不具“彗星”的完整细胞,且形成的“彗星”总是靠近没有“彗星”的完整细胞。

实验发现,“彗星”形状随吸收剂量而变化,因此,借助与辐照的参考样品的比较可以估测受照样品的吸收剂量。

即使此法有一定的局限性,但它可广泛用作辐照食品检测的预筛选方法[10],检测步骤于下:

（1）制备细胞悬液;

（2）将单细胞埋置在显微镜载片上的琼脂中;（3）用Tris（三羟甲基

氨基甲烷）-硼酸盐缓冲剂（45mmol.L-1Tris-硼酸盐,1mmol.L-1EDTA）配制的2.5%硫酸十二烷基钠（SDS）（PH8.0）溶胞10min,4）使用步骤（4）中同样的缓冲液,在2V.cm-1电势降条件下水下电泳（Submarineelectrophoresis）2min;（5）载片用银染色后在显微镜下观察。

不同实验室对鸡和猪肉样品（1kGy-5kGy）进行的盲测结果表明:

总数129个样品,成功检测达91.5%,与辐照的参考样品组比较,估测剂量与实际剂量一致率达87%。

线粒体DNA有较小的分子量（大约含16000个碱基对）,比细胞DNA稳定。

如,线粒体DNA不受循环冷冻、融解过程影响,另外线粒体壁能保护其中DNA在样品贮藏期间不受酶降解作用影响。

从这些意义上讲线粒体中DNA链断裂可看作是辐照专一的。

2、利用辐照形成的长寿命自由基检测辐照食品（ESR）

电离辐射是产生自由基的重要手段,在电离辐射作用下形成的原始产物——激发分子、正离子和电子都能进一步反应产生自由基。

在一个体系中,大多数自由基的寿命很短,通过自由基相互反应很快消失,对应用电子自旋共振法检测辐照食品意义不大。

只有一些特殊的体系（如干燥固体样品）或含有硬组织（如骨头、钙化的表皮、硬果壳、籽、核等）体系,辐照在这些食品上产生的自由基因扩散困难,自由基间相互反应受到限制,仅具有扩散能力小的活性自由基才能与他们反应,所以上述食品中产生的自由基通常有较长的寿命,对辐照食品的检测具有实际意义。

自由基含有未成对电子,具有净电子自旋角动量,因此可用电子自旋共振（ESR）波谱技术测定。

当处于均匀外磁场H中时,电子能级分裂成为高能级和低能级,两能级间的能量为:

ΔΕ=gβH

式中g称光谱分裂因子,在大多数因子,在大多数自由基中,自由基奇电子的g值与自由电子的g值（ge=2.00232）相接近;β称为Bohr（玻尔）磁子;H为磁场强度。

当样品吸收某一频率的电磁辐射（满足hv=ΔΕ=gβH）时,处于低能级的电子将跃迁到高能级上,同时产生吸收谱。

因为电子由低能态向高能态跃迁必须满足hv=ΔΕ=gβH,所以g可表示为:

g=×

这样g成为v和H的比例因子。

在实验条件下,v是选定的,例如在磁场强度为0.3T—1.3T（特斯拉）磁场内,电子自旋跃迁所要求的频率约对应于9000兆周S-1—3600兆周S-1。

因此可把任何共振磁场H看作是g因子变化造成的。

G因子表征未成对电子最大共振吸收的磁场位置,是未成对电子所在的那个自由基的特征量。

根据上面讨论,自由基的顺磁共振谱仅有一条谱线。

自由基之间的区别也就是g值的微小不同。

实际上测得的谱线往往有数条,这归因于自由基未成对电子与其邻近磁性核的相互作用。

因此,未成对电子处于外磁场和邻近磁性核产生的磁场中,合成磁场支配着能量吸收。

一个未成对电子和核自旋角动量I相互作用后,可以得到2I+1条间距和强度都相等的谱线。

如氢原子的核磁场H’在外磁场中有（2×1/2）+1）个取值,即+H’和-H’,因此电子处于H+H’或H-H’的磁场中,相应有两个吸收峰。

当电子自旋和n个自旋I1相同的等价核相互作用时分裂出的谱线为2nIi+1;当同时和n1个核自旋为I1的等价核、n2个核自旋为I2的等价核……、nr个核自旋为Ir的等价核相互作用时分裂出的谱线数目为:

N=（2n1I1+1）（2n2I2+1）……（2nrIr+1）

由于超精细相互作用的出现,大大提高了顺磁共振技术的价值,使得根据电子顺磁共振谱鉴定自由基成为可能。

例如,甲基自由基CH3,他有3个等价核（H）,IH=1/2,因此他有4条精细结构谱线。

为了检测辐照食品,自由基ESR信号必须满足几个要求:

（1）ESR信号必须是稳定的,或者至少在通常的贮藏时间内是稳定的。

（2）在较长时间贮藏后,辐照样的ESR信号必须仍能与未辐照样品中的ESR信号清楚地区分。

（3）信号强度必须正比吸收剂量。

这样可利

用这种关系估测受照样品的吸收剂量。

在自由基的ESR波谱研究中,常用g因子和ΔΗ特征ESR信号（图3）。

g因子可用下式计算得到:

g=hv/βH0。

式中,H0为中心磁场强度,他通常有基线ESR信号间的交点求得,β为Bohr磁子,h为谱朗克常数,v为共振点的微波频率或电子共振频率,因此上式可表示为:

g=71.4484v（GHz）/H0（mT）。

ΔΗ表示峰一峰间的距离,它由图3一次微商谱线求得。

过去和最近的研究结果都表明,ESR方法可成功地用于某些含骨头或钙化组织的辐照食品的检测,也可用于其他的干燥食品和香辛料调味品的辐照检测。

ESR方法的优点是准确、灵敏,可以检测0.2kGy剂量辐照的食品,并可用以估测受辐照食品的吸收剂量。

缺点是在进行ESR测量前必须将样品研磨成一定大小的颗粒,此过程本身也可以产生自由基,此外,ESR设备昂贵并需要专业技术人员。

3、利用热释光分析技术检测辐照食品（TL）

当固体样品受电离辐射时,部分自由电子或空穴被晶格缺陷所俘获,这些晶格缺陷称为陷阱。

陷阱吸引、束缚异性电荷的能力称为隐阱深度。

当陷阱很深时,在常温下电子或空穴可被俘获几百年、几千年乃至更长的时间。

当样品被加热时,在陷阱中的电子获得能量,一些电子可从陷阱中逸出,当逸出的电子返回到稳定态时,就伴随有热释光发射。

如果带脑子被陷落在不同深度的陷阱中,则随着温度的升高,首先逸出的是浅陷阱中的电子。

因此记录到的光发射是加热温度的函数,而发光曲线则几个“发光峰”组成。

热释光方法（TL）检测辐照食品最初是测量食品受热时发射的热释光强度,一般步骤:

（1）称一定量的样品（5mg—25mg）,置于小盘中。

为了避免小盘受热时样品成分蒸发粘着在盘上或污染探测器,通常在样品上盖一小玻璃片,或者将样品放在两玻璃片之间。

（2）工作时,测量室（检测器室或加热室）用稳定的氮气流（约4L/min）充满。

（3）线性加热（10℃/秒）小盘中的样品,大约在30秒内将样品从环境温度升至280℃,加热开始后,立即用热释光分析仪测量发射光的强度于是得温度函数的发光曲线。

热释光现象比较普遍地存在于辐照和未辐照的固体样品中,因此要区分辐照和未辐照样品,就需要一个建立在广泛实验基础上阈值,将未知样的TL强度值与阈值比较,若未知样的TL强度值大于阈值,则次样品是辐照的,相反则是未辐照的。

自从上世纪八十年代末Sanderson发现香辛料和草本植物的热释光来源于粘着在其表面的无机矿物质（如硅酸盐、石英、粘土等）以后,人们对热释光方法的研究就从测量整个样品（样品和粘着的矿物质）的热释光转向测量矿物质的热释光[16]。

目前测定矿物质的热释光方法已成功用于香辛料、草本植物（草药）、水产品、水果、蔬菜以及所有沾染硅酸盐矿物质并能使之分离的辐照食品的检测。

此法包括:

（1）从食品中提取矿物质。

提取前,所有使用的玻璃器皿和材料必须小心清洗以除去灰尘和粘着的无机颗粒。

样品置于密度为1.7g.cm-3的多钨酸钠（Na6W12O39?

H2O）溶液中,用超声波处理。

之后离心分离,弃去上层游记物质。

下层富集的矿物馏分用去离子水清洗二次以回收多、钨酸钠溶液,在每次除去清洗液之前放置5min或做短时间离心,使大于20μ-30μ的矿物颗粒沉降。

矿物馏分接着用1mol.L-1HCl处理1.5min（处理时间随样品而异,例如虾和对虾样品,处理时间为10min）以除去碳酸盐,并按上述操作用去离子水清洗三次（或先用NH4OH中和再用去离子水清洗）、继之用丙酮中的矿物质转移至平底烧瓶中并使之沉降到不锈钢小盘中,小盘在50℃过夜干燥后供测量热释光用。

（2）热释光测量

样品制备完成后,立即测量热释光发光曲线（第一发光曲线）,温度一般从室温升至400℃,升温速率6℃/s,对记录的第一发光曲线积分或对某温度区域的发光曲线积分给出样品的TL强度或样品在该温度区域TL强度,以G1表示。

由于不同类型的矿物质辐照后发射的TL

强度有很大的差别,这导致从辐照产品分离的矿物质有不同的热释光强度。

因此要更正确判断食品是否辐照,热释光强度需要归一化。

为此,在测量样品的第一发光曲线后,该样品再用60Co源β源再辐照,再辐照剂量通常为1kGy。

接着在与测量第一发光曲线完全相同的条件下测量样品的发光曲线（第二发光曲线）,其TL强度用G2表示。

G1/G2称为热释光信号。

比较两次测量所得的热释光谱,若两者很相似,并且第一次TL强度与再辐照后的TL强度的归一化比值G1/G2≈1,则此样品至少已用1kGy剂量辐照过;若两谱明显不同,G1/G2<0.1,则样品是未辐照的。

G1/G2通常随所取积分温度范围而变化,因为样品的天然TL强度与温度有关。

一些陷落在浅阱中的载流子,在通常条件下很容易被光漂白,它们的形成速率小于衰减速率,因此天然TL只有在较高温度（>300℃）时才能测量到。

而辐照样品在较低温度（200℃-300℃）区域都能产生热释光。

所以辐照和未辐照样品间热释光强度的差异在较低温度区域回中等温度区域最为明显并常常选择中等温度区域的G1/G2作为评估样品是否辐照的基础。

此法对于10kGy辐照的香辛料和草本植物产品,在辐照后2年仍能清楚地与未辐照样品区分。

用测量矿物质的热释光方法检测辐照食品有灵敏度高,无需参照物和辐照专一等优点。

4、辐照食品检测技术的发展现状与展望

据2003年的最新统计,全球已有38个国家和地区批准了548中食品和调味品可用辐照处理,其中1986年以后辐照食品被批准的总数达到392种。

1983年,FAO/WHO的食品法典委员会（CAC）正式颁发了《辐照食品通用法规》,从法律上消除了辐照食品国际贸易上的障碍。

采用辐照处理以提高食品的卫生质量和减少食源性疾病的发生已成为人们的共识,辐照食品已逐步被社会公众接受和认可。

国际上为了对辐照食品进行有效地管理和良好的辐照工艺控制,对辐照食品的批准已转向类别化。

各国正着手制定按辐照食品分类的卫生标准和工艺标准,因此,按类别进行辐照食品的检测和分析将成为今后几年辐照食品检测技术的研究和发展方向。

综上所述,利用辐照产生的化学效应方法、电子自旋共振方法、热释光分析法已成功用于某些辐照食品检测,目前也已被国际辐照界所认可。

近年来,利用食品辐照后物理性质（如电性质、粘度等）和化学变化、生物学特征（如组织和形态特征）的变化、微生物系统的变化、昆虫的变化等检测辐照食品也进行了大量的研究工作,并在一定程度上也已取得成功。

然而,上述每一方法的适用范围不尽相同,适宜检测的辐照食品也不一样,每一方法均存在一定的局限性。

为了确保分析检测结果的可靠性,目前大多采用两种或两种以上的方法进行分析检测,这样不仅测试费用昂贵,且费时费力,难以适用于不同类别的辐照食品的检测与鉴别。

因此,今后辐照食品检测技术的发展方向为:

1）通过国际间作研究现有的分析检测方法发展为国际级标准方法;2）加强辐照食品辐射加工剂量测定方法研究;3）研究简便、快捷、准确的检测技术,加强多学科的协作攻关,以发展通用性更好的辐照食品检测技术。

制定相应的按类别检测的辐照食品分析技术标准,以适应我国在国际贸易中辐照食品鉴定和检测的需要,进一步推动食品辐照保藏技术的研究和发展。