动物主基因QTL的定位策略.docx

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动物主基因QTL的定位策略

动物主基因QTL的定位策略

本研究给出了从数量性状主基因（QTL）的统计学检测到定位在很小的染色体片段上（如小至2Mb以下）的全过程的一套思路．总结了包括单遗传标记与口rL、两个或多个标记与QTL的连锁分析在内的统计模型，其中比较了使用最大似然法和最小二乘法进行区间定位的优缺点。

1数量性扶（或阈性状）基因效应分析——主基因（QTL）定位的前提

主基因、QTL及其一般分布

一是由分析数量性状（或阈性状）而判定明显存在常染色体或性染色体上的孟德尔基因，绵羊的FecB及FecX基因就是典型的代表；另一类是一些遗传缺陷基因，其遗传方式已明确，通过进一步与有关经济性状进行连锁分析后，认定该基因为某性状的主基因，这种情况下，基因往往是一因多效的

仅据表型检测主基因的方法

直到现在大多数QTL的检测都很困难，仅根据表型资料只能检测巨效基因，分离分析法被证明是最有效的方法，对表型数据的分析以检测主效基因是否存在可以减少QTL定位的盲目性

2荤标记与数量性状（或闻性状）的连锁分析一一候选基囡法定位主基因（QTL）的统计方法

Smith和Simpson（1986）指出中等以上效应QTL的检测必须在家系内进行，直到目前连锁分析大部分是采用专门的试验设计（代试验设计、回交设计、孙女设计等）在畜禽中现已有遗传标记（包括基因）与QTL连锁的例子Cowam等（1990）“”采用广义最小二乘法对一头Holstein公牛的26头雄性F代的催乳紊（Prolactin）位点不同基因型效应进行了分析，结果发现两种纯合型PDM（产奶量预测差）的传递力相差282．93kg。

但在群体中的多态分离情况及在其它家系中的连锁分析结果可能是不同的，另一方面连锁程度及所涉及的位点数也不能由这些数据得到。

3遗传连锁图谱与主基因（QTL）定位

区间定位——最大似然法

改进的区间定位方法——最小二乘法

4合并图谱与基因精细定位

利用这种合并图谱，已将几个人类致病基因缩小到2cM以下的区间上，在这样的区间上进行位置克隆是不难的粘粒克隆、YACs、BACs、Pls等DNA大片断克隆系统的发展，使构建由这些克隆组成的重叠群成为现实，流式细胞分离术使单条染色体得以被分离，染色体微切割技术可以从染色体的中部切下10~15Mb、从端部切下3～5Mb的目的片段，随之产生的微克隆术与其它方法一起大大丰富了STSs，YAC重叠图谱与STSs图谱的有机结合及相互补充，必将能够对许多主基因（QTL）缩至足够小的染色体片段上，从而适合于进行标记辅助选择或位置克隆。

水稻抽穗期基因的精细定位、克隆和生物学功能分析

lQTL定位

在F2群体中定位

日本晴和Kasalath的平均抽穗期分别为122和117d，F2群体抽穗期的变异很大（104～164d），并且是连续的，抽穗期的频率表现出双峰分布及超亲分离，说明该组合中存在控制抽穗期的具有较大效应的基因和效应方向相反的基因

在回交后代群体中定位

从（日本晴／Kasalath／／日本晴）发展了85个株系组成的BCIF5群体，定位了5个抽穗期QTL~43，其中2个效应较大，分别与Hd1和Hd2处于同一区间，另外3个QTL的阈值较低，在F2群体中未能检测到，这3个QTL后来被命名为Hd7、Hd8和Hdl5l

在高回交世代群体的定位

以日本晴为轮回亲本，对日本晴／Kasalath组合进行多次回交和筛选，得到1株植株BC4Fa一37—7，其基因组中上述8个抽穗期QTL中7个所在的区间均为日本晴等位基因纯合，只有少数区间，包括第2染色体上Hd7所在区间为杂合，在该植株自交后代中，抽穗期表现出22d的连续变异。

2QTL的精细定位

为了对Hd1、Hd2和Hd3进行精细定位，以日本晴为轮回亲本与日本晴／Kasalath的后代进行回交，对BCIF2代的个体，以均匀分布在水稻12条染色体上的50个RFLP标记筛选这3个目的基因座位上分别为Kasalath等位基因纯合型的单株，与日本晴回交，经筛选和再回交，得到3株合适的BC3Fa植株，经128个RFLP标记的筛选，它们分别在3个目的基因区域为杂合型，而在几乎所有其他区域（包括目的基因以外的其他抽穗期QTL）均为日本晴等位基因纯合型，这3个单株就被分别用作进行Hd1、Hd2或Hd3的精细定位的F1植株，在它们自交所得F2群体中，只有单个QTL发生分离

林木数量性状位点定位的统计方法

单个标记分析，基本上可用3种方法进行：

一是基于分子标记分类的数量性状均值差异是否显著来判断所用标记的影响（加性或显性教应），若蔗异显著（如用t测验）说明该标己与所研究性状关联．否则无关；二是回lj]方法，应用数量性状与分子标记基因型（转化为数量化指标如0，1）进行回岫分析，对所得的回归系数进行测验来判断杯记与数壤性状的关联l吐，然而这一方法缺点是假设每～标记组内的昕研究的性状分布为正志的；三是似然法．该方法可应用于每个标记娄刊内的混合J下态分布类型，可估计标记iQT1之间重组率，通过对似然函数进行偏导以取得极大值似然参数估计，井应用仍然比方法或相应的以1c]勾底的对数（LOD值）对所用的标记影响进行测定

与单个标记分析不同，区间作围能够将QT1效应和其在两个标记所包含的区间内位置同时进行钟析，其作图过程可用2种方法进行：

一是最大似然洼，其原理是假设数量性状位点处于两个标记的区间内．根据重组后出现的标记类型，构造出响应的似然函数．对每⋯参数分别求导．求得最1人似然解，然后用迭代疗法求收敛解，井采用似然比测定和根据LOD值大小确定QTI位置；二是回l上]分析法．即将数量性状对成埘标记进行回l『=『分析，对偏回归系数的非零值测定用，推测出QTI在该对标记的相对位置．该法也吖推广到l司时对多个标记进行定位分析。

遗传学研究中有关基因定位的方法及比较应用

微卫星方法：

微卫星是大多数真核基因组中大量而随机出现的简单序列的串联重复。

由于它们常短于lOObp长度插在具有单一序列的DNA内，故它们能用PCR方法体外扩增。

它们易于被克隆并特征化，由于重复单位数目的变异，故可显示出重要的多态性。

这种多态性足以稳定的用于遗传分析。

但是微卫星方法不适于种及种以上水平的研究。

所以导致这种方法被使用的局限性。

连锁分析法：

连锁分析是基因定位中的主要策略之一。

它是利用家系遗传信息中的基因问的重组率计算出两基因之间的染色体图距。

根据疾病有无合适的遗传模式。

可分别进行参数分析与非参数分析。

参数分析法：

即一般所指的连锁分析法。

这是著名遗传学家NewtonMorton于1955年在Fisher似然性估计的原理上提出的一种优势对数分析法（Lod法），主要检测在两基因以某一重组率0相连锁时。

出现这种情况的似然性L有多大。

Lod法计算的统计量是Z（Lodscore）。

计算公式是Z（O）=log（O）／L‘l／2可简单定义为连锁（0≤0

非参数分析法：

此法不依赖于疾病的遗传模式，被认为是多基因疾病的理想分析法。

这是一种建立在等位基因共享基础上的分析法，其研究对象限于家系中成对的患病成员，通过比较两个患病者在同一座位上获得的来自共同祖先的同一等位基因的频率，将之与按盂德尔分离方式所应获得的期望频率相比较，若两者问差异有显著性，则可认为该等位基因与致病基因存在连锁不平衡

医学分子遗传学

克隆基目的定位

克隆基因定位法就是采弓已被克隆基因的eDNA探针与保留在杂种细胞内的人染色体DNA顺序根据两者的同原性进行分子杂交，以确定克隆基因究竟位于哪条染色体上。

随机DNA片段的定位

这一定位方法通常是先甩限制性内切酶将来喜人体细胞的全部DNA切割成大约i5—20kb大小的片段，然后插λ噬菌体中，构建成^体基因组文库在获得单一l师序片段后，按照克隆基因定位相同的方法，利用杂种细胞，将它们分别定位在特定的人染色体上

专性染色体DNA片段的定位

这种定位方法称为专性染色体DNA片段的定位。

专性染色体DNA片段的菝得有两种方法：

（1）首先构建只含有单条^染色体的杂种细胞，从中提取出DNA，将人和鼠的DNA区分开来，最后分离出单一顺序片段：

（2）采用流式细胞分类仪分离出单条^体染色体，再从中分离出单一l咂序片段。

从专性染色休中分离得到DNA片段后，可采用缺失杂种细胞系，将这些片段定位在这一染色体的特定区域内。

重复顺序与染色体精细结构定位

在人类基因组中含有70％以上的重复顺序，其中大部分分布于整个基因组的单一顺序之间。

在这些重复顺序中，有的重复顺序达到几十万甚至几百万个拷贝，如Alu重复顺序家族就由300．000个拷贝组成。

而另一些类型的重复顺序仅含有几千个或更少的拷贝。

当这类几千个拷贝的重复顺序与仅含一条人染色体的杂种细胞DNA进行杂交时，可显示出一些清楚的带型。

这些带型代表着染色体的不同区域。

因此，这种重复顺序探针可以用来作为特定染色体内不同位点的遗传标记

原位杂交与基因定位

它的基础是必须分离和克隆获得特定的基因或随机DNA片段。

将这些克隆片段甩同位紊’H标记作为探针，直接在玻片上和中期染色体杂交，经过放射自显影就可显示出这一基因在染色体上的杂交位置

基因定位的概念和方法

l基因定位的概念

基因定位（geneLocation）就是将基因定位于某一特定的染色体上，以及测定基因在染色体上线性排列的顺序和距离

2基因定位的方法

2．1标记基因系法

标记基因系是指带有一个以上已知位点的标记基因的品系。

该法实际上是对待定位基因与已知位点的标记基因进行连锁分析，如果待定位基因与标记基因呈连锁遗传，即可推断待定位基因与标记基因位于同一染色体上，可根据二点测验、三点测验的原理确定该待定位基因在该染色体上的排列顺序

2．2家系分析法

通过这种方法很早就知道血友病和色育的基因处在X染色体上；也可以通过是否与已知X染色体上的基因连锁来确定某一基因是否在X染色体上，如已知血型基因X。

在X染色体上，而普通鱼鳞病（ich）和眼白化症（OA）基因与之连锁，由此推论它们也在X染色体上，计算子代的重组率，即可确定两个基因间的相对距离。

2．3接合转移定位法

这是定位细菌基因的方法。

接合转移是指两个单细胞通过彼此间的暂时连接，使其中一方接受另一方的遗传物质的现象

2．4细胞学方法

当细胞学观察的染色体异常与某一基因所表达的异常同时出现时。

此基因就可定位于这一染色体的异常区

2．5体细胞杂交法

利用亲缘关系较远的动物或植物细胞融合后亲代细胞一方的染色体逐渐丢失的特点．结合对杂种细胞的生化或免疫检测，可以把基固定位在幕一染色体上

2．6非整倍体法

非整倍体包括单体、缺体和三体。

利用非整倍体定位有两种不同的方法．一是经典的非整倍体分析。

二是用酶作标记，根据基因剂量效应。

定位酶基因

2．7相互易位系法

相互易位杂合体在减数分裂前期I配对形成十字形图象。

在后期I肓邻近分离和交互分离两种方式．前者形成的配子都不育。

后者形成的配子可育。

因此相互易位杂合体是半不育的

2．8限制性内切酶法

用限制性内切痔切割DNA分子。

可得到许多DNA片断。

通过凝胶电泳，可将长度不同的片断分开

2．9染色体原位杂交法

这是一项利用标记的DNA探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子坏记技犬

2．10染色体步行和染色体跳跃法

染色体步行法是通过相互重叠的基因组克隆之间进行一连串的杂交而进行基因定位

2．11DNA全序列测定

基因是DNA分子中具有遗传效应的一段核苷酸序列，一旦染色体DNA全序列搞清楚了，基因在染色体上的位置也就闸明了，因此基因组的全序列测定是基因定位的最高目标．

2．12数量性状基因定位

分子标记将基因组染色体的全长划分成连续的若干小区，在世代传递过程中藉DNA分子标记追踪这些小区的遗传．使数量性状基因定位成为可能