stratagenemx3005荧光定量实验方法操作手册.docx
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stratagenemx3005荧光定量实验方法操作手册
Stratagene定量PCR仪标准曲线制作方法
定量PCR定量的基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释的样品作出标准曲线，未知样品和标准曲线相比较从而得到未知样品的量。
无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检测应用中都有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。
标准样品的准备
1、绝对定量。
绝对定量就是要确定未知样品的拷贝数。
对于这类实验标准品是通过某种方法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列。
最常见的是插入有目标序列的质粒，因为质粒是环状DNA有较强的稳定性，而且分子量比较大定量的时候比较准确。
也有用线状的PCR产物作为标准品的，通常要比扩增的目标片段要大一些，这也是为了获得分子量比较大的片段，提高拷贝数的准确性。
标准品的拷贝数是通过紫外定量的方法来确定，先得到标准品的浓度C（ng/uL），因为无论是质粒还是PCR产物它们的序列都是已知的，这样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量B，则标准品的拷贝数A（copy/uL）为：
A=C/B×+14
2、相对定量。
主要是针对基因表达分析实验而来的，因为要知道都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。
实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。
将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。
最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合这种基因的扩增）。
而对于各个稀释倍数要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量，当然在基因表达分析中也不需要，而是要求根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。
比如可以把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。
要注意，赋值的数目的倍数差异和稀释的倍数应该是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。
如何做标准曲线
在定量实验中标准品是要和未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得了Ct值。
那么先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然对于相对定量来说这个拷贝数是我们自己赋予的）。
这样可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。
一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。
事实上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来了。
举例来说如何进行设置
1、先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上unknow或standard等信息。
2、选择要使用的荧光染料。
3、设置复孔。
如果有些孔有重复就用用样的数字标明，这样仪器就知道哪些是重复，最终结果处理的话也可以取平均等操作。
有相同标号的系统就认为是同样的样品的重复。
4、标准品赋值
接下来要给标准品赋上值，系统要知道按照什么去计算
标准品赋值要先选上要赋值的标准品，然后在工具面板中输入相应的值。
为了方便设置系统有一个自动增加稀释倍数的设置，点开后就可以选择你的稀释倍数，然后用鼠标去选择孔的时候会自动增加
选择稀释倍数
每次选择不同的孔，在里面赋的值会自动按照倍数增加
5、设置温度
在这里提供一个对于SYBR染料常用的温度的控制模板，可以参考。
注意最后的溶解曲线制作过程在升温的过程中选择标有all的放大镜，代表从55℃到95℃逐渐升温的过程中不停的检测荧光信号。
6、设好了之后可以运行程序了，最后的标准曲线和扩增曲线系统会自动给出，也会算出未知样品的拷贝数。
Stratagene荧光定量PCR仪基因表达分析解决方案
Stratagene荧光定量PCR仪和配套的Mxpro软件在处理基因表达分析方面的功能比较强大，下面简要说明如何使用该软件来进行基因表达分析。
例如要分析IL1基因的表达情况，用看家基因GAPDH作为内参，采用的是SYBRGreenI染料法。
1、板设置
、专门的基因表达分析实验模式。
打开Mxpro程序操作窗口，首先弹出的对话框是要用户选择要进行的实验类型，做基因表达分析可以选择第二项ComparativeQuantitation（Calibrator）。
、方便的类型选择和孔设定。
在板设置中选择样品的类型，可以将样品的名称写成GAPDH和IL1，并将GAPDH设为看家基因（NORM），这样设置非常清晰，有利于分析结果。
如果实验中使用了复孔，则在复孔上标上相同的数字，代表这些样品是重复，下图中每个样品重复三次。
基因表达分析实验同一个cDNA既要做目的基因，也要做看家基因。
看家基因和目的基因来自同一样本的用相同的字母来标记，如果是对照样品则标上Calibrator。
、方便而快捷的反应条件设定。
可以很容易设定扩增反应条件和熔解曲线条件。
2、结果分析
、多种分析结果可供选择
扩增曲线，其中红色表示目的基因，绿色表示看家基因（和板设置中选择的颜色相同）
标准曲线，看家基因和待测基因的标准曲线都能被作出来，并显示出分别的扩增效率。
如果不做标准曲线，用户也可以根据经验写入扩增效率的值，这样最后的计算结果也可以根据用户写入的扩增效率进行计算。
扩增效率的引入方法是点软件操作界面上方的Termsettings键
，打开Analysistermsettings对话框，点里面的EfficiencySettings，在efficiency框中输入不同基因的扩增效率。
熔解曲线，其中红色表示目的基因，绿色表示看家基因，峰位置代表产物的Tm值的温度，图中可以看到看家基因和待测基因的产物基本具有相似的Tm值。
基因表达差异柱壮图显示，程序可以自动计算出基因表达的差异，并用柱壮图显示出来，每一个柱表示一个样本，基因表达的趋势清晰可见，对照样本被算为1。
柱壮图还可以表示成Log的形式，这样可以清楚分开上调和下调的样本。
数据文本显示，实验得到的数据可以以文本的形式显示出来，用户可以很直观的看到用于计算的具体数据，自己也可以利用这些数据进行统计计算。
、数据导出
实验产生的结果都可以方便地导出，图片可以导成图片格式、Excel图片或Powerpoint等，数据也可以导入Excel或文本文件中。
多种数据的导出形式。
基因表达分析板设置方法
Stratagene荧光定量PCR仪的应用软件MxPro提供了比较强大的基因表达差异分析功能，要很好的运用这些功能的前提是要告诉仪器一些必要板设置信息。
下面举例子来说明如何来进行板设置。
在这里举一个例子，用SYBRGreenI染料法，用GAPDH作内参，检测不同样品中LI1的基因表达差异，在这里要设置各自的标准品样品和阴性对照等信息。
首先打开分析软件，选择基因表达分析一项
基本信息设置：
软件首先出现的界面就是板信息设置界面。
先选中要放置反应管的位置A-D四行，接下来就是在程序界面的右边的设置命令面板上给选中的孔上填入信息。
信息的输入顺序一般是从上到下的。
首先要选择孔的类型（Welltype）。
在孔类型中可以选择Unknow（未知样品），Standard（标准品），NTC（阴性对照）等。
为了方便起见，我先将所有的孔都设置成Unknow。
然后再选择使用的荧光染料，这里由于只用到了SYBRGreenI一种荧光染料，所以就选上SYBR。
如果实验当中用了几种荧光染料，就可以将这几种荧光染料都选中。
当选中了荧光染料之后，板设置的基本信息已经输入电脑了，实验可以运行了。
以下信息可以在实验进行之前设置，也可以在实验结束之后再设置。
不同基因设置：
由于做基因表达分析实验通常要做目的基因和看家基因，所以接下来要告诉软件目的基因和看家基因的名字，软件才能加以区分。
点Assignassayname打开如下对话框
由于用SYBR染料做两种基因，所以应该在SYBR后面的Assay栏中写入看家基因和目的基因名称。
假设前两排是GAPDH，后两排是IL1，则可以在assignassayswithinselectedwells中选择SYBR并输入GAPDH和IL1的名称，同时你可以选择一个颜色代表不同的基因。
这样系统就可以分辨哪个孔是什么基因了。
用红色代表IL1
这时候软件只知道在这个实验中检测了两个基因，而哪个基因是看家基因并不知道，下一步是要告诉系统哪一个是看家基因，在Normalizingassay中选择GAPDH就可以了
这时候原来图上的GAPDH就变成了NORM
重复设置：
接下来设置重复，每一个样品设置了三个重复。
如果一个样品重复三次，这些相同重复的样品可以标上同样的一个数字，这时系统就知道标有同样数字的孔是重复样品，将来在分析数据的时候可以对这些样品进行取平均等操作。
标准品设置：
先将标准品和未知样品分开，在本实验中A行为看家基因的标准品，C行为目的基因的标准品。
分别选择A行和C行，在Welltype下拉菜单中选择Standard将其设置成标准品类型。
在设置命令面板Standardquantity中写入标准品的量。
可以利用Auto-Increment来自动设置稀释的倍数。
样品组织分类：
看家基因和目的基因未知样品应该对应起来，即同一个cDNA样品应该既作了目的基因也作了看家基因。
再接下来把来自同一个cDNA的样品的目的基因和看家基因扩增标出来。
可以在Identifyassociations中的下拉菜单中选择一个字母来标记用同一个cDNA模板分别扩增目的基因和看家基因的孔。
上图中的ABCD表示标号相同是来自同一份组织，这样就把同一份组织中的看家基因和目的基因对应了起来。
选择对照样本：
在基因表达实验中总要选择一个cDNA样本作为基因表达的基准，比如实验中会有一个正常样本，最后的表达结果作为1，所有其他的样本的基因表达量都和它相比较，这个作为基准的样品称为Calibrator。
在板上选中这个cDNA样品对应的目的基因和看家基因，在welltype中选择calibrator。
这样板设置就完成了。
熔解曲线设置方法
熔解曲线的原理
定量PCR的荧光标记方法通常有两种，一种是探针法，一种是染料法。
染料法通常指的是用SYBRGreenI染料作为荧光标记。
SYBRGreenI这种染料之所以可以用来定量，是因为它的特殊性质决定的。
第一，它可以非特异性地结合到双链DNA的小沟处，和单链DNA以及蛋白都不结合。
第二，SYBRGreenI这种染料游离存在的情况下它没有荧光，一旦它和双链DNA结合了，再用一定波长的光激发它时就可以发出很强的荧光（大概是游离状态的1000倍）。
我们再想PCR的过程，PCR的最终产物正是双链DNA，随着每次的循环双链DNA产物的数量成指数增长。
如果把SYBRGreenI这种染料加入到反应体系中，就可以随着每次循环结合到双链DNA产物上。
产物的量越多，结合的染料就越多，染料发出的荧光就和产物的量成正比，因此通过检测SYBRGreenI的荧光就可以时实监控PCR反应的产物变化。
SYBRGreenI染色法的优越性是使用方便，不用专门设计探针。
想检测不同的基因只用在PCR体系中加入同一种荧光物质就可以。
而且价格非常便宜，因此在科研领域里还是非常常用的。
但它主要的缺点是灵敏度不够。
因为SYBRGreenI可以和DNA双链非特异性的结合，那么如果PCR反应有非特异性的扩增产物或引物二聚体的话也会结合这种染料，因此实验的结果往往就会受到一些因素的干扰。
当采用SYBRGreenI染料法做定量PCR实验时为了确定实验产物中有没有引物二聚体或非特异性的引发，一般要在反应结束之后做一个熔解曲线。
熔解曲线的原理是根据SYBRGreenI染料只和双链DNA结合的特性，设计一个从55℃到95℃逐渐升温的过程，随着温度的升高，双链DNA在不断的解链，SYBRGreenI染料的结合数量也在减少，发出的荧光也越来越少，当到达产物Tm值的时候，荧光信号突然下降，然后趋于平缓，这时双链完全解开，不发荧光。
一个典型的熔解曲线如下（纵坐标是荧光信号强度，横坐标是温度）：
通过数学换算，荧光信号变化最快的温度就可以换算出一个峰，这个峰的位置就代表产物的Tm值。
如果产物当中有多种组分比如引物二聚体（如下图），这样就会出现多个峰，这样就可以判断出是否有引物二聚体或其他组分，反应条件是否需要优化。
Stratagene软件如何进行熔解曲线设定
Stratagene软件熔解曲线实验方法设定有两种
拖到温度曲线上
1、利用Allpoint检测。
Stratagene软件具有两种检测荧光检测方式，一种是Endpoint
另一种是Allpoint
，Endpoint是在整个反应步骤的末尾检测荧光信号，Allpoint是在整个反应步骤中尽可能多的检测荧光信号。
所以就可以利用Allpoint在55℃到95℃升温过程中检测荧光信号。
设置方法是将Allpoint标志
从设置命令面板上拖到温度曲线上。
2、利用循环升温设置。
这是利用PCR仪每个循环温度可以升高一定温度的特性来做的。
先设计出如下的温度曲线形式：
在40个循环的反应结束后，又设计了两个Segment，3和4。
Segment3是升温到95℃，1个循环。
接着设置Segment4中的温度，可以双击55℃的温度平台打开如下对话框：
在Cycleincrements中设置循环温度升高幅度。
如果设计每个循环升高0.2℃，则在Temperature中输入0.2℃，如果从55℃升温，每次增高0.2℃则需要进行201个循环才能到达95℃，所以循环数应为201。
在Datacollection中选择Type为Endpoint，#ofendpoints设定为1（只采集一次荧光信号），设定结果如下：
最后得到的温度曲线设置图是：
SNP检测应用
荧光定量做SNP检测的原理
SNP（singlenucleotidepolymorphisms）即单核苷酸多态性，是人类基因组中最简单的一种多态性形式，是指在不同的基因样本中，的某一位点只有一个碱基的不同。
虽然DNA的组成中有4种碱基，但在SNP中一般只有两个碱基的互换，所以它是一种二态性的标记。
正因为SNP的这些特点，要用荧光定量PCR技术检测某一未知样品是否有某一位点的SNP，就只需要设计两条探针分别用不同的荧光标记，这两条探针只在这个SNP位点有一个碱基的不同。
最后用定量PCR反应检测是哪一种荧光被释放出来了，就可以说明该位点应该是怎样的SNP。
最后介绍如何用定量PCR的办法来检测未知样品的SNP位点。
如图，例如我们已知某一位点可能发生A到C的SNP变化，因此我们可以设计两种探针在该位点分别设成T，G。
只有一个碱基的差异，分别把这两种探针标记成不同的荧光。
这样在PCR反应过程中，探针只有和模板完全匹配荧光才能被释放出来，所以根据检测到是哪种荧光就可以确定是否有相应的SNP位点。
这是检测结果，左边的检测到一种荧光，说明这个样本的该位点只含有一种碱基。
而右边的图中两种荧光都被检出，说明这些样本中两种碱基的SNP都有。
Mx3000P中SNP分析功能
Mx3000P定量PCR软件中提供了专门的强大的SNP分析功能。
当用户打开软件后首先看到的是实验类型的选择包括：
普通定量，相对定量，SNP分析，只读板实验等，根据用户的需要可以选择不同的实验，就可以进入不同的实验模式开展实验了。
如果要进行SNP分析可以有两种选择，可以选择第四项AlleleDiscrimination/SNP’sReal-Time，就进入专业的定量SNP分析程序界面，也可以选择最后一项PlateRead/AlleleDiscrimination进行专业的SNP终点判别。
定量SNP分析
是指利用定量PCR扩增的方法检测SNP，可以选择实验类型对话框中的第四项AlleleDiscrimination/SNP’sReal-Time
在板设置框中用户可以轻松设置样品类型、名称、所用荧光素等必要信息。
由于SNP分析中需要进行类型的判定，所以必须设立可靠的对照，一般实验当中要设立两种荧光的阴性对照和阳性对照，还要有空白对照才能进行结果判定。
结果运行后有强大的分析功能，包括扩增曲线分析、双点图分析、板数据计算、板结果显示和结果文本显示等功能。
非常方便易用用户可轻松掌握。
用户如果只想通过终点判读的方法分析SNP也可以选择最后一项PlateRead/AlleleMx3000P
只读板定量分析
是指在PCR反应结束之后，利用定量PCR的荧光读取功能，对反应的终点进行检测，再通过软件来判断SNP分型的方法。
Mx3000P软件提供了PlateRead/AlleleDiscrimination功能，进入只读板模式来分析SNP，Mx3000P同样提供强大的分析功能。
一般实验当中也要设立两种荧光的阴性对照和阳性对照，还要有空白对照才能进行结果判定。
荧光定量PCR在基因表达分析中的常见问题
所谓基因表达就是指在特定的时刻某种感兴趣的基因在组织或细胞中的mRNA的表达数量。
众所周知，很多的疾病（如肿瘤）的发生发展，很多药物的作用机理，很多生物的代谢调控作用等都和基因表达的变化有关，因此对基因表达进行精确定量是十分重要的。
过去为了对mRNA进行定量有了各种各样的方法，如Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、传统PCR等，但是我们也都知道这些技术灵敏性较差，重复性不好，操作比较烦琐，已经无法满足现在科研和检测的需要，于是荧光定量PCR技术也就应运而生了。
荧光定量PCR技术能对核酸进行精确定量，因此大大提高了在基因表达的准确性和灵敏度，广泛的应用于肿瘤研究、药物筛选、功能基因组研究等各个领域，目前已经成了很多科研文章发表的重要实验内容。
基因表达分析中常见到的问题
1、采用什么样的荧光标记方法？
荧光标记方法一般有两种，一种是探针法，另一种是染料法，即使用SYBRGreen染料。
由于探针合成的成本比较高，探针设计也有一定的难度，所以在基因表达分析中经常采用SYBRGreen染料法进行荧光定量检测。
检测的原理是SYBRGreenI游离状态下不发荧光，但当反应体系中有双链DNA存在的情况下SYBRGreenI就可以非特异性的结合到DNA双螺旋的小沟处，发出很强荧光。
这样随着PCR反应的进行，产物也在不断积累，结合到双链PCR产物上的荧光也就越来越多。
通过检测荧光信号强度就可以反映出反应体系中产物的积累变化情况。
这种SYBRGreenI染色法的优越性是使用方便，不需要针对不同的基因专门设计探针。
想检测不同的基因只用在PCR体系中加入同一种荧光物质就可以。
而且价格非常便宜。
但它主要的缺点是灵敏度不够，如果PCR反应中产生了引物二聚体也同样会造成荧光信号的积累，因此在做实验前往往需要对实验条件进行摸索。
2、要检测的基因有哪些？
基因表达分析的目的就是检测某种我们感兴趣的基因在不同组织或细胞中的表达差异。
荧光定量PCR技术可以对核酸物质的含量进行精确的定量，也就成了研究基因表达差异的一把利器。
在基因表达分析实验中要检测两个基因，一个是目的基因另一个是看家基因。
之所以要引入看家基因最主要是由于不能确定要比较的样品所用的组织起始量相同。
就是说比如提取正常样品的基因时用了100个细胞，而提取病变样品时只用了10个细胞，这时候的基因表达差异可能是由于提取时候的样品细胞数不同引起的。
为了纠正这种误差，选用认为在两个样本中表达量不变的看家基因作为内参照，来去除样品细胞数不同而带来的干扰。
例如，要研究某个基因在肿瘤样品和正常样品中的基因表达差异。
在实验中发现要研究的正常样品中的看家基因的表达量是肿瘤样品中的10倍，就认为正常样品的细胞数就是肿瘤样品细胞数的10倍，那么在肿瘤样品中目的基因的基因表达量应该乘以10倍，才能和正常样品进行比较。
3、什么是扩增效率？
从理论上来说PCR的扩增应该按照2的倍数向上递增，这样的扩增效率我们认为是100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是100%，甚至有时因为实验条件、选用试剂、稀释等存在的问题扩增效率还有可能高过100%。
扩增效率可以通过标准曲线来计算出来，它只和标准曲线的斜率有关。
PCR扩增效率=10（-1/slope）–1
4、基因表达差异如何计算？
基因表达差异的计算是通过所得到的Ct值来计算的，要计算两个样品（待测样品和对照样品）的目的基因的表达差异必须检测得到4个Ct值：
待测样品和对照样品中目的基因和看家基因的Ct值。
那么基因表达差异应该计算为
基因表达差异=2（△Ct1-△Ct2）
这是公式的推导过程是根据PCR的基本原理而来的。
PCR每次循环的产物量的积累过程应该是以2的倍数进行增长，即下一次循环是上一次循环产物量的2倍。
如果正常样本的起始模板数是X，待测样本的起始模板数是Y，那么当两个样本都达到域值时，它们的产物量应该是一样的，如果这个时候两个样本的Ct值分别为Ct1和Ct2，则有：
X×2Ct1=Y×2Ct2
待测样本和对照样本起始模板数之比应为：
Y/X=2Ct1/2Ct2=2△Ct1
同理待测样品和对照样品中看家基因的起始模板的比就应该是：
Y’/X’=2Ct1/2Ct2=2△Ct2
这样经过看家基因纠正的基因表达差异应该是：
基因表达差异=2（△Ct1-△Ct2）
这个公式的前提是看家基因和目的基因的扩增效率相同并且都为100%，因为只有这个时候产物的增长速度才有2倍的关系，否则就要引入目的基因和看家基因的扩增效率E1和E2来修正这个公式。
5、标准品如何准备？
从理论上说基因表达分析实验是不需要标准品的，因为无需精确定出研究的组织或细胞中的某种基因的真实拷贝数，感兴趣的只是目标实验组和对照组的某种基因表达量的比值，也就是说想要得到的只是一个相对的数值和真实的拷贝数没有直接的关系。
那么在一些实验中为什么还要做标准曲线呢？
这是为了纠正扩增效率不同的问题。
从理论上来说PCR的扩增应该按照2的倍数向上递增，这样的扩增效率我们认为是100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是100%，尤其在不同的基因的扩增中间。
因为基因表达分析实验用到了目的基因和看家基因两种基因，这样这两种基因的扩增效率会有所不同。
那么如果用看家基因来校正目的基因就会带来误差，刚才的公式也就不再适用了。
这样考虑到看家基因和目的基因不同的扩增效率，就需要做标准曲线来精确反应样品管中基因的相对含量。
基因表达分析标准品的准备相对比较简单，因为要知道的都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。
实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。
将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。
最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。
而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行
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