氧化还原酶的实验方法.docx

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氧化还原酶的实验方法

氧化还原酶的实验方法

1

（1）方法与原理

在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚或三元酚氧化成醌。

以邻苯二

酚氧化成相应的二醌为例，

CH（OH）+1/2O?

CHO+HO64226422

（2）试剂配制

1%邻苯三酚溶液，乙醚，0.5N盐酸，重铬酸钾标准溶液（0.75gKCrO溶于1L0.5NHCl），227pH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液

标准曲线绘制：

取重铬酸钾标准溶液，用0.5N盐酸稀释成各种不同浓度。

定容后，在

分光光度计上于430nm处比色测定。

以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。

（3）操作步骤

取1g鲜土（过2mm筛），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液，摇荡后放在30。

C恒温箱中培养2h。

（为了减少误差，建议以下操作在冰盘上进行）取出后加4mlpH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力振荡数次，萃取30min。

最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。

比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。

为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子酚的纯度，需设无基

质的土壤和无土壤的基质作对照。

在无基质的土壤对照中，用水代替基质进行培养。

（4）活性表示

紫色没食子素的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。

多酚氧化酶活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克数表示。

2.

（1）方法与原理

在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚或三元酚氧化成醌。

以邻苯二

酚氧化成相应的二醌为例，

CH（OH）+1/2O?

CHO+HO64226422

（2）试剂配制

1%邻苯三酚溶液，乙醚，0.5N盐酸，重铬酸钾标准溶液（0.75gKCrO溶于1L0.5NHCl），227pH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液

0.5%过氧化氢

标准曲线绘制：

取重铬酸钾标准溶液，用0.5N盐酸稀释成各种不同浓度。

定容后，

在分光光度计上于430nm处比色测定。

以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。

（3）操作步骤。

C恒温箱中培养2h。

（为了减少误差，建议以下操作在冰盘上进

取1g鲜土（过2mm筛），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液和2ml0.5%行）取出后加4mlpH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力振荡数次，萃取30min。

过氧化氢，摇荡后放在30最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。

比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。

为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子酚的纯度，需设无

基质的土壤和无土壤的基质作对照。

在无基质的土壤对照中，用水代替基质进行培养。

（4）活性表示

紫色没食子素的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。

多酚氧化酶活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克数表示。

3

（1）方法与原理

过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程

中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

可根据过氧化氢的消耗量或氧气

的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶

促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。

即可求出消耗的

HO的量。

22

（2）操作步骤

称取2g鲜土于100mL的三角瓶中,然后吸取40mL蒸馏水注入上述三角瓶中，再加入

5mL0.3%过氧化氢溶液。

将三角瓶置于振荡机上，振荡20分钟。

温度控制在20?

+2?

。

振荡结束后，立即加入5mL3N的HSO于三角瓶中，使之钝化，即使未分解的HO稳定，用慢2422

速滤纸过滤。

过滤结束后吸取25mL滤液于100mL三角瓶中，用0.1N的KMnO滴定，滴至溶4

液微红（30s不褪色），即达终点，记录消耗高锰酸钾的毫升数（V）。

1

对照试验（无基质对照）：

不加土样，其他同上，消耗的高锰酸钾毫升为V2

计算：

M=（V-V）T/g，T为校正值。

21

高锰酸钾的浓度用草酸钠滴定。

称取0.67g在105?

烘至恒重的草酸钠，蒸馏水定容到100ml（0.05mol/L）,取5ml上述溶液加5ml3N的硫酸溶液，在75?

水浴中，用高锰酸钾标定，根据消耗的高锰酸钾毫

升数，求得高锰酸钾的浓度。

高锰酸钾溶液的标定

--与CO可以发生如下反应：

424

+2+--5CO+2nO+16H=2Mn+8HO+10CO24422根据氧化还原反应原理可以判断，在酸性溶液中，MnO

由上述化学反应方程式可知滴定终点是，5molNaCO恰好与2molKMnO完全反应，即：

2244

C（KMnO）=2m（NaCO）/5*134.00*V（KMnO）42244因此，通过称量NaCO的质量，经滴定，根据公式即可算出KMnO的准确浓度。

2244

4.

调整后的方法：

（调整原因：

容器不同，同时无漩涡混合仪等。

注意：

土壤和基质要充

分混合；密封和敞口的测定结果相差很大，注意密封）

土壤脱氢酶活性测定:

称取5g新鲜土样于100ml的具塞塑料瓶中,加入1.0%pH7.6TTC-Tris缓冲溶液5mL,在37?

下培养24h后加入50mL甲醇,振荡2～3min后过滤,490nm下比色测定。

标准曲线制作：

（1）用100mgTTC溶于100mlTris-HCl缓冲液（标液）；

（2）取0，1，2，4，6，8，10ml标液用Tris-HCl缓冲液定溶到50ml；（3）取以上系列溶液各1ml，加1ml10%Na2S，到容量管中，放置40min，显色,再用甲醇定容到20ml;（4）在490nm下比色，在比色皿中稳定两分钟。

镧对红壤转化酶过氧化氢酶和脱氢酶活性的影响

土壤脱氢酶活性测定[8]:

称取2.5g新鲜土样于容量管中,加入1.0%TTC-Tris缓冲溶液（pH7.6）2.5mL,漩涡混合仪振荡1min,在37下培养24h后加入25mL甲醇,振荡2～3min后过滤,比色测定.根据标准曲线计算

-1-1生成物TPF的浓度，以TPF（mg*kg*d）表示脱氢酶的活性。

[8]ChanderK,BrookesPC.Isthedehydrogenaseassayinvalidasamethodtoestimatemicrobialactivityin

copper-contaminatedsoils?

[J].SoilBiol.Biochem.,1991,23:

909-915.

（1）方法与原理

过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程

中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

可根据过氧化氢的消耗量或氧气

的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶

促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。

即可求出消耗的

HO的量。

22

（2）操作步骤

称取2g小麦秸秆于100mL的三角瓶中,然后加入40mL蒸馏水，6ml3%过氧化氢溶液。

将

SO于三角瓶中，使24之钝化，即使未分解的HO稳定，用中速滤纸过滤。

过滤结束后吸取20ml滤液于100mL三22三角瓶置于振荡机上，振荡20分钟。

振荡结束后，立即加入5mL3N的H角瓶中，用0.1N的KMnO滴定，滴至溶液微红（30s不褪色），即达终点，记录消耗高锰酸4

钾的毫升数（V）。

1

对照试验（无基质对照）：

不加小麦秸秆，其他同上，消耗的高锰酸钾毫升为V计算：

2M=（V-V）T/g，T为校正值。

21

高锰酸钾的浓度用草酸钠滴定。

称取0.67g在105?

烘至恒重的草酸钠，蒸馏水定容到100ml（0.05mol/L）,取5ml上述溶液加5ml3N的硫酸溶液，在75?

水浴中，用高锰酸钾标定，根据消耗的高锰酸钾毫

升数，求得高锰酸钾的浓度。

高锰酸钾溶液的标定

根据氧化还原反应原理可以判断，在酸性溶液中，MnO--与CO可以发生如下反应：

424

+2+--5CO+2nO+16H=2Mn+8HO+10CO24422由上述化学反应方程式可知滴定终点是，5molNaCO恰好与2molKMnO完全反应，即：

2244

C（KMnO）=2m（NaCO）/5*134.00*V（KMnO）42244因此，通过称量NaCO的质量，经滴定，根据公式即可算出KMnO的准确浓度。

2244

（1）方法与原理

在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚或三元酚氧化成醌。

以邻苯二

酚氧化成相应的二醌为例，

CH（OH）+1/2O?

CHO+HO64226422

（2）试剂配制

1%邻苯三酚溶液，乙醚，0.5N盐酸，重铬酸钾标准溶液（0.75gKCrO溶于1L0.5NHCl），227pH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液

标准曲线绘制：

取重铬酸钾标准溶液，用0.5N盐酸稀释成各种不同浓度。

定容后，在

分光光度计上于430nm处比色测定。

以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。

（3）操作步骤

取2g小麦秸秆，置于100ml三角瓶中，然后注入20ml1%邻苯三酚溶液，摇荡后放在30。

C恒温箱中培养2h。

（为了减少误差，建议以下操作在冰盘上进行）取出后加8mlpH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，萃取30min（用力振荡数分钟充分萃取）。

最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。

比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。

为了消除样品种原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子酚的纯度，需设无

基质的秸秆和无秸秆的基质作对照。

在无基质的秸秆对照中，用水代替基质进行培养。

（4）活性表示

紫色没食子素的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。

多酚氧化酶活性，以2h后1g样品中紫色没食子素的毫克数表示。

（1）方法与原理

选用无色的TTC作人为受体，脱氢酶能酶促TTC受氢后生成红色的三苯基甲替（TF），通过测定红色TF的生成量表示酶的活性。

（2）试剂配制

pH7.6Tris-HCl缓冲液，0.1mol／L，0.5TTC，0.1mol／L，甲苯

标准曲线绘制：

称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50ml容量瓶中，定容（1mgTTC/ml）;分别向6只50ml容量瓶中依次注入1，2，3，4，5，6ml1mg/ml标准TTC溶液，用蒸馏水定容，是为工作液；去7支20ml容积带塞试管，依次加入2mlTris-HCl缓冲液，1ml0.5TTC，1ml10%NaS新配溶液，摇匀，放置20min（对照管不加TTC）；反应完全2

后，各管分别加入5ml甲苯，振摇，完全提取TF，稳定数分钟，取上层有机溶液在492nm处比色。

以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。

（3）操作步骤

取2g样品于带盖塑料瓶中，依次加入pH7.6Tris-HC1缓冲液、0.1mol／L葡萄糖液、0.5TTC各2mL，置入37士1?

恒温箱中培养4h。

取出，加2滴浓硫酸终止反应，准确加入

10mL甲苯，振摇5min，在4000rpm下离心5min，取有机溶剂层在492nm处进行比色，在上述条件下，将1h产生1／μgTF的量为一个酶活力单位。

（比色时要进行稀释）

（4）活性表示

TF的量由标准曲线查得，脱氢酶活性用TFμg?

g-1-1?

h表示。

（1）方法与原理

在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚或三元酚氧化成醌。

以邻苯二

酚氧化成相应的二醌为例，

CH（OH）+1/2O?

CHO+HO64226422

（2）试剂配制

1%邻苯三酚溶液，乙醚，0.5N盐酸，重铬酸钾标准溶液（0.75gKCrO溶于1L0.5NHCl），227pH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液

标准曲线绘制：

取重铬酸钾标准溶液，用0.5N盐酸稀释成各种不同浓度。

定容后，在

分光光度计上于430nm处比色测定。

以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。

（3）操作步骤

取1g小麦秸秆，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液和2ml5%过氧化氢，摇荡后放在30。

C恒温箱中培养2h。

（为了减少误差，建议以下操作在冰盘上进行）取出后加4mlpH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力振荡数次，萃取30min。

最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。

比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。

为了消除秸秆中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子酚的纯度，需设无基

质的秸秆和无秸秆的基质作对照。

在无基质的秸秆对照中，用水代替基质进行培养。

（4）活性表示

紫色没食子素的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。

过氧化物酶活性，以2h后1g小麦秸秆中紫色没食子素的毫克数表示。