永泰芙蓉李总多糖的分离分析.docx

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永泰芙蓉李总多糖的分离分析

永泰芙蓉李总多糖的分离分析

作者：

李雪琼，于丽丽，陈丹，张传銮，年扎白姆

【摘要】目的分离纯化芙蓉李中的总多糖并成立其含量测定方式。

方式采用水提醇沉法从芙蓉李果实中提取多糖，用大孔吸附树脂、Sevag法等技术纯化多糖，采用纸色谱法辨别多糖中单糖的种类;以多糖含量为指标，苯酚-硫酸法为测定方式，采用正交实验法优选最佳测定条件。

结果芙蓉李粗多糖提纯物中多糖平均含量为%，苯酚和硫酸的用量、反映温度等对含量测定结果有显著影响，而反映时间的影响较小，方式平均回收率为%，RSD为%（n=6）。

结论第一次从芙蓉李中提取取得粗多糖;所成立的含量测定方式准确、靠得住，可作为其质量控制的方式。

【关键词】芙蓉李;多糖;苯酚硫酸法;含量测定

Abstract:

ObjectiveToisolate，purifythetotalpolysaccharidesandtoestablishamethodforassayofpolysaccharidesinFurongPolysaccharideswereextractedfromFurongplumbywaterextractionalcoholprecipitationmethod,purifiedbymacroporousadsorptionresinandSevagmethod,monosaccharidesinpolysaccharidesofFurongplumwereidentifiedbypaperchromatography.Thecontentofthepolysaccharidewasdeterminatedbyphenolsulfuricacidmethod.Orthogonaltestwasconductedtoselecttheoptimalconditionsforthedeterminationofpolysaccharide.ResultsVolumesofphonelandsulfuricacid,andreactiontemperaturehadsignificanteffectsondeterminationresults,andreactiontimehadnosignificanteffectondeterminationresults.TheaveragecontentsofpolysaccharidesextractedfromcrudepolysaccharidespreparedfromFurongplumwas%.Therecoveryratewas99.38%with%ofRSD（n=6）.ConclusionCrudepolysaccharideswereextractedfromFurongplum,andquantifiedbyphenolsulfuricacidmethodisaccurate,stable,andapplicableinthedeterminationofpolysaccharidesinFurongplum.ThemethodsmightbeusedinthequanlitycontrolthepolysaccharidesinFurongplum.

　　Keywords:

Furongplum;polysaccharides;phenolsulfuricacidmethod;assay

　芙蓉李（PrunussalicinaLindl.cv.Furong）为蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）植物李的果实，始载于《滇南本草》，又名夫人李、浦李、李实。

主产于福建永泰县梧桐乡，有430连年的栽培历史，是福建省李树的主栽品种，其中尤以福建永泰芙蓉李道地。

李子性甘、酸、苦、平，入肝、脾、肾三经，具有健胃消食的功效;其中所含活性成份具有降气导滞、清肝涤热、生津利水的功能;中医用于医治肝虚有热、虚劳骨蒸、胃阴不足而致的口中干渴和腹水等症[1，2]。

经课题组前期研究表明，芙蓉李中含有黄酮及其苷类成份、多糖类成份、有机酸类成份、多酚类等成份[3]。

多糖普遍存在于自然界，具有多种生物活性，包括免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌、抗病毒、保护肝脏等[4、5]。

目前国内外已有关于欧洲李果实中多酚及多酚抗氧化作用的研究报导[六、7]，未见有关永泰芙蓉李果实中多糖的研究，为了开发利用这一植物资源，笔者对芙蓉李中多糖进行了分离纯化并辨别其中单糖的种类，运用正交设计实验对多糖含量测定方式的条件进行了考察，并对其含量进行了测定。

　　1仪器与试药

　　仪器

　　UV9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）;RE52旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;4802型紫外可见分光光度计（龙尼柯上海仪器有限公司）;OHAUS2140电子分析天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）。

　　试药

　　芙蓉李（产地福建永泰，福建中医学院中药鉴定教研室范世明高级实验师鉴定）;无水D葡萄糖（中国药品生物制品检定所，110833200503）;D葡萄糖、D半乳糖、D果糖、D甘露糖（国药集团化学试剂有限公司）;AB8大孔吸附树脂（型号D101，天津市光复精细化工研究所）;乙醇、苯酚、硫酸、苯胺、邻苯二甲酸等试剂均为分析纯。

　　2方式与结果

　　永泰芙蓉李粗多糖的提取分离

　　称取芙蓉李果1000g，剪碎，加滚水约2000mL，反复提取3次，每次1h，滤过，搜集、归并提取液，浓缩，得芙蓉李粗多糖提取液。

　　芙蓉李粗多糖的纯化

　　大孔吸附树脂的预处置称取大孔吸附树脂1000g，用体积分数95%乙醇浸泡24h充分溶胀，装柱后不断用体积分数95%乙醇洗脱至流出液加水（1∶5）不浑浊，改用大量蒸馏水冲洗，洗至无醇味为止，蒸馏水浸泡备用。

　　芙蓉李多糖的纯化称取处置好的大孔吸附树脂100g，湿法上柱。

精密吸取芙蓉李提取液100mL上柱。

静置，吸附一段时间后，用蒸馏水洗脱，至洗脱液对Molish反映呈阴性。

搜集洗脱液，浓缩。

浓缩液加乙醇使醇含量达80%，静置24h，抽滤，滤渣依次用无水乙醇、丙酮洗涤，取得粗多糖。

将粗多糖溶于水，用Sevag法除蛋白[8，9]，反复进行3次至无蛋白吸收峰。

多糖溶液经再次醇沉，静置，得浅紫色絮状沉淀，搜集沉淀，抽滤，真空干燥，即得浅灰紫色芙蓉李多糖半纯品无定形粉末。

　　芙蓉李多糖中单糖组成的初步分析

　　供试品溶液的制备取多糖半纯品g，置10mL的安瓿瓶中，加入1mol/L硫酸5mL，封瓶，100℃酸水解8h，水解液用碳酸钡中和，滤过，滤液浓缩后供纸色谱点样用。

　　对照品溶液的制备别离取D甘露糖、D果糖、D半乳糖、D葡萄糖等各mg，置1mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，供点样用。

　　纸色谱分析将多糖酸水解供试品溶液、各单糖对照品溶液别离点样于新华1号中速层析滤纸上，用正丁醇乙酸乙酯异丙醇乙酸吡啶水（体积比7∶25∶12∶7∶6∶5）为展开剂，展开，掏出，晾干。

以苯胺邻苯二甲酸显色，105℃烘烤10min。

结果显示芙蓉李多糖水解供试液在葡萄糖斑点出现的相应位置有相同的红棕色斑点出现。

　　芙蓉李多糖的含量测定

　　对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的无水D葡萄糖对照品g，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含mg的葡萄糖对照品贮备液。

精密量取对照品贮备液mL，别离置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含mg的对照品溶液。

　　供试品溶液的制备称取干燥至恒重的芙蓉李粗多糖半纯品约g，精密称定，用少量热水溶解，定量转移至25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液4mL，置50mL的量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

　　测定波长的选择精密量取对照品溶液和供试品溶液各2mL，按“标准曲线”项下同法操作，在400～600nm波长范围扫描，结果显示对照品和芙蓉李多糖在490nm波优势有最大吸收。

吸收光谱见图2。

　　分析条件的选择取供试品溶液，按“含量测定”项下同法操作，以苯酚用量、硫酸用量、反映时间和水浴温度为考察因素[10]，采用L9（34）正交设计实验，别离测定吸光度，选择最佳分析实验条件。

因素与水平及实验结果见表1～3。

表1因素水平表表2正交实验结果表3苯酚硫酸法测定多糖显色因素方差分析

　　（2,18）=,（2，18）=由直观分析及方差分析结果可知，各因素对多糖含量影响大小顺序为A>B>D>C，即苯酚用量>浓硫酸用量>反映温度>反映时间;苯酚用量、浓硫酸用量对多糖含量的影响具有极显著性（P<,反映温度的影响也有显著性（P<，反映时间的影响则没有显著性。

综合以上结果，肯定苯酚-硫酸法最佳分析反映条件为A1B2C1D1，即5%苯酚mL，硫酸mL，反映时间16min，反映温度80℃。

　　标准曲线的制备精密量取对照品贮备液0、、、、、mL，别离置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

别离精密量取各溶液mL，置具塞试管中，别离加苯酚mL，摇匀，迅速加入浓硫酸mL，混匀，放置6min，80℃水浴加热5min，掏出后冰水浴中放置5min，静置10min，以0号为空白，在490nm的波优势测定吸光度。

以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=+，r=5，表明葡萄糖在2～10μg/mL的线性范围内呈良好的线形关系。

　　精密度实验别离精密吸取供试品溶液6份，按“项下同法持续操作，RSD为%。

　　重复性实验别离精密称取同一批干燥至恒重的永泰芙蓉李多糖半纯品6份，按“项下同法操作，测定，多糖的平均含量为%，RSD为%。

　　显色稳定性实验取同一供试品溶液，按“项下同法操作，显色后，每隔5min测定一次吸光度。

结果表明溶液在显色45min内吸光度稳定。

　　加样回收率实验别离精密称取同一批干燥至恒重的永泰芙蓉李总多糖半纯品g6份，各精密加入葡萄糖对照品贮备液10mL，按“项制备供试液，按“项下同法操作测定吸光度，计算平均回收率和RSD值。

结果见表4表4加样回收率实验结果

　　含量测定精密吸取2mL供试品溶液，置具塞试管中，按“项下同法操作，测定吸光度，代入回归方程计算，平行测定3份。

总多糖平均含量%,RSD为%。

　　3讨论

　　永泰芙蓉李总多糖可溶于水，在空气中易吸收水分，故实验之前均需进行干燥处置，并寄存于干燥器皿，以避免影响实验的准确度。

　　纯化多糖的方式有多种，本实验通过大孔吸附树脂除去粗多糖中的黄酮类、多酚类等可溶于乙醇的成份，再通过Sevag法除去蛋白，醇沉法分离多糖，达到较好的纯化效果。

　　采用苯酚硫酸法测定多糖含量，实验操作中应注意加入的浓硫酸mL应直接迅速加到溶液表面，加酸后应充分摇匀，至颜色稳定（10min）后进行测定，实验证明结果在45min内稳定。

　　纸色谱初步分析实验结果表明，芙蓉李多糖主要由葡萄糖等组成，芙蓉李多糖的组成结构和生理活性尚有待进一步的深切研究。

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（2）:

16-18.