生物分离的双水相体系中最常用的是PEG/Dextran和PEG/无机盐体系。
超临界流体萃取中，被萃取物可通过等温减压或等压升温的办法与萃取剂分离，而萃取剂只需重新压缩便可循环使用。
超临界流体萃取特别适合于热稳定性较差的物质，尤其是天然产物的分离，同时产品中无其他物质残留。
液膜通常由膜溶剂90%以上、表面活性剂1-5%，流体载体1-5%组成。
表面活性剂起乳化作用，直接影响膜的稳定性、渗透速率、分离效率和膜的重复利用；添加剂用于控制膜的稳定性和渗透性。
液膜分离体系中，含有被分离组分的料液作连续相称为外相；接受被分离组分的液体称为内相；处于两者之间的成膜的液体称为膜相。
液膜按构型和操作方式可分为乳状液膜和支撑液膜。
无载体液膜主要有三种分离机理，即选择性渗透、化学反应、萃取和吸附。
有载体液膜分离过程主要决定于载体的性质，载体输送分为逆向迁移和同向迁移两种。
液膜分离操作过程分四个阶段，即制备液膜、液膜萃取、澄清分离和破乳。
破乳法有化学、离心、过滤、加热和静电破乳法等。
泡沫分离是以气泡为介质，依据各组分的表面活性的差异而分离混合物的方法。
泡沫分离的操作是由两个基本过程组成：
①待分离的溶质被吸附到气－液界面上；②对被泡沫吸附的物质进行收集并用化学、热或机械的方法破坏泡沫，将溶质提取出来。
因此它的主要设备为泡沫塔和破沫器。
Cohn经验式lgS=β-KSμ，S为蛋白质的溶解度，μ为离子强度，Ks为盐析常数，β为当离子强度为零，也就是蛋白质在纯水中的假想溶解度的对数值，在蛋白质等电点时最小。
膨胀床吸附是能在床层膨松状态下实现平推流的扩张床吸附技术。
离子交换过程是液固两相间传质和化学反应过程，速率主要受离子在液固两相间的制约。
离子交换树脂的交联度以交联剂用量的质量百分数表示。
交换势是树脂对不同反离子亲和力强弱的反映。
色谱法在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时首次采用。
色层分离过程包括：
①加试样；②展开；③分部收集。
色谱峰高一半处对应的峰宽称为半峰宽Y1/2，色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离称为峰底宽度Y。
塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提。
某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，此色谱柱的理论塔板数为1600块。
分离度R为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，R值越大，表明相邻两组分分离越好，通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。
疏水作用色层分离法的首要条件是基质和配基及其偶联，琼脂糖类凝胶是应用最广泛的疏水介质。
离子交换色谱分离介质上被吸附物质的洗脱方法有三种：
恒定溶液洗脱、线性梯度洗脱和逐次洗脱。
凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
样品进入凝胶层析柱后，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
亲和色谱分离的基本过程可分为三个主要步骤：
①配基的固相化；②亲和；③解离。
凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。
计算题：
1利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D（ActinomycinD），pH3.5时分配系数K=61采用三级错流萃取，令H＝610dm3/h，三级萃取剂流量之和为42dm3/h。
（1）计算Vs1=Vs2=Vs3时的萃取率。
（2分）
（2）计算Vs1＝21，Vs2=12，Vs3=9dm3/h时的萃取率。
（3分）
（3）操作条件不变，计算采用多级逆流接触萃取时使收率达到99%所需的级数及其实际收率。
（5分）
解:
2已知物质A和B在一个30.0cm柱上的保留时间分别为16.52和18.02min，不被保留组分通过该柱的时间为1.23min，峰宽为1.42和1.58mm。
计算：
（1）柱的分离度；（2分）
（2）柱的平均塔板数及塔板高度；（4分）
（3）达到1.5分离度所需的柱长度及洗脱A物质所需时间；（4分）
解：
简答题：
1、简述浊点现象产生的原因。
答：
①温度升高，表面活性剂胶束集聚数增加，使得胶束的体积增大而引起相分离；
②非离子型的表面活性剂靠分子内的亲水基与水分子通过氢键结合而溶于水中，加热
时，氢键的结合力会减弱甚至消失，但温度超过某一范围时，表面活性剂不再水合
而从溶液中析出产生混浊等。
2、解释错流过滤并简述其优点。
答：
错流过滤：
在泵的推动下料液平行于膜面流动，料液流经膜面时产生的剪切力把膜面上滞留的颗粒带走，从而使污染层保持在一个较薄的水平。
3、简述膜通量衰减的原因及其解决办法
答：
原因及方法：
①浓差极化的影响，是可逆的污染，通过降低料液浓度或改善膜面料液流体学条件，采用湍流促进器和设计合理的流通结构等方法，减轻已经产生的浓差极化现象，使膜的分离特性得以恢复。
②不可逆污染，溶质吸附和粒子沉积在膜面形成凝胶层，降低膜的水力渗透性和渗透通量，并可形成长期而不可逆的污染，这时，对膜进行清洗未必有效，部分膜的产水能力可能永久丧失，此时就需要更换新膜。
5、基因工程包涵体的纯化方法。
答：
①机械破碎（高速匀浆、研磨）—离心提取包涵物—变性剂溶解—除变性剂复性
②机械破碎—膜分离可溶性蛋白—加变性剂溶解包涵体—除变性剂复性
③化学破碎（加变性剂）—离心除细胞碎片
6、包涵体表达的有利因素。
答：
①可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
②降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
③包涵体中杂蛋白含量较低，只需简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
④对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于粘壁，并与细胞膜碎片分离。
7、选择细胞破碎方法时要需要考虑哪些因素。
答：
①破碎目的：
完整细胞器或分子；生物活性。
②待破碎生物体类型：
不同生物体对破碎有不同敏感度，可以通过破碎率来测定，
其值取决于对未损害完整细胞的分析技术。
8、超临界流体萃取特点
答：
1.同时具有液相萃取和蒸馏的特点。
2.它的萃取能力取决于流体的密度，而密度很容易通过调节温度和压力来加以控制。
3.溶剂回收很简便，并能大大节省能源。
被萃取物可通过等温减压或等压升温的办法与
萃取剂分离，而萃取剂只需重新压缩便可循环使用。
4.可以不在高温下操作，因此特别适合于热稳定性较差的物质，尤其是天然产物的分离。
同时产品中无其他物质残留。
5.操作压力可根据分离对象选择适当的萃取剂或添加夹带剂来控制以避免高压带来的
影响。
9、何为膜污染，膜污染是哪些途径造成？
如何有效防止和清除膜污染？
答：
膜污染：
随着操作时间的增加，膜透过流速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降。
途径：
主要由膜的劣化和水生物（附生）污垢所引起的。
（1）膜的劣化：
由于膜本身的不可逆转的质量变化而引起的膜性能变化。
①化学性劣化②物理性劣化③生物性劣化
（2）水生物（附生）污垢：
是由于形成吸着层和堵塞等外因而引起的膜性能变化。
①吸着层②堵塞
预防和清除：
①预处理法②开发新型抗污染的膜③加大供给液的流速。
10、什么是亲和膜分离技术？
答：
亲和膜分离是将亲和层析与膜分离技术结合起来以提高过程选择性的一项新型分离技
术。
兼有膜分离和亲和色谱的优点，可有效地进行生物产品的分离和纯化。
11、简述生物技术下游加工过程的一般步骤和单元操作
答：
1、不溶物的去除（固液分离）——预处理包括过滤、离心、细胞破碎等，产物浓度和质量得到了提高。
凝聚和絮凝，错流过滤等。
2、产物提取（浓缩）产物初步纯化的过程。
将目标产物与性质差异较大的杂质分开，可大幅提高产物浓度。
往往多单元协同操作，如吸附、萃取、沉淀、超滤等。
3、产物的精制产物被高度纯化，除去与目标物性质接近的杂质。
采用的技术具有产物的高选择性和杂质的去除性，即可以除去微量的杂质。
如沉淀、电泳、层析等。
4、成品加工将纯化的产品按要求制成商用成品。
按商品要求的用途、纯度、剂型等进行最后加工。
如浓缩、结晶、喷雾干燥、冷冻干燥等。
12、简述渗透蒸发过程的特点。
答：
（1）分离系数大，选择合适的膜，单级就能达到很高的分离度。
（2）过程操作简单，附加的处理少，但有相变，故能耗高；
（3）过程不引入其它试剂，产品和环境不会受到污染；
（4）便于放大及与其它过程耦合和集成
（5）渗透通量小，与反渗透等过程相比，渗透蒸发的通量要小得多
（6）渗透蒸发虽以组分的蒸汽压差为推动力，但其分离作用不受组分汽-液平衡的限制，而主要受组分在膜内的渗透速率的控制。
（7）在操作过程中，进料侧不需加压，所以不会导致膜的压密，因而其透过率不会随时间的增加而减小。
14、反渗透膜分离机理。
答、反渗透膜选择性地只能透过溶剂的性质，对溶液施加压力，克服溶剂的渗透压，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。
即在渗透装置的膜两侧造成一个大于渗透压的压力差，溶剂从溶液中分离出，使得浓度较高的溶液进一步浓缩的膜分离。
反渗透膜是属于一种压力推动的膜滤方法，所用的膜不具离子交换性质。
反渗透用半透膜为滤膜，必须在克服膜两边的渗透压下操作。
13、简述MF、UF、NF、RO及其适用情况。
答：
（1）反渗透（RO）反渗透是利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂的性质，对溶液施加压力，克服溶剂的渗透压，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离。
可用于从水溶液中将水分离出来，以及海水和苦咸水的淡化。
（2）超滤（UF）超滤是指按粒径选择分离溶液中所含的微粒和大分子的膜分离操作。
即根据大分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别进行分离的方法。
可从小分子溶质或溶剂中，将比较大的溶质分子筛分出来。
（3）微滤（MF）微过滤是以多孔细小薄膜为过滤介质，使不溶物浓缩过滤的操作。
适用于细胞、细菌和微粒子的分离。
（4）纳滤（NF）介于RO和UF之间的膜分离过程，膜孔径1-10nm，膜上常带电荷，可分离低分子量有机物和多价离子，主要用于半咸水脱盐、水软化、生物制药、微污染物脱出及废水治理等。
15、简述提高超临界流体萃取中溶剂选择性的基本原则。
答：
①操作温度应和超临界流体的临界温度相接近，超临界萃取剂的临界温度越接近操作温度，则溶解度越大；
②超临界流体的化学性质应和待分离溶质的化学性质相接近，与被萃取溶质化学性质越相似，溶解能力越大。
16、常用的膜组件有哪些？
答：
膜组件主要有平板型、圆管型、螺旋卷绕型、中空纤维型四种，它们分别简称为板式、管式、卷式和中空纤维式。
18、简述凝胶过滤层析的原理。
答：
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的网状结构会形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，速度慢，所以最后流出。
17、超临界流体的选择原则
答：
①化学性质稳定，对设备没有腐蚀性，不与萃取物反应；
②临界温度应接近常温或操作温度，不宜太高或太低，最好在室温附近或操作温度附近；
③操作温度应低于被萃取溶质的分解或变质温度；
④临界压力不能太高，以节省动力费用；
⑤对被萃取物的选择性高（容易得到纯产品）；
⑥纯度高，溶解性能好，以减少溶剂循还用量；
⑦容易获得，价格便宜；
⑧如果用于食品和医药工业，还应考虑选择无毒溶剂
19、简单阐述亲和膜分离技术与亲和—错流膜过滤法的区别？
答:
①亲和膜分离技术，制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离；
②亲和—错流膜过滤，将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与产物进行特异反应，然后用膜进行错流过滤。
20、生物物质的萃取与传统的萃取相比有哪些不同点？
答：
（1）成分与相复杂；
（2）传质速率不同；（3）相分离性能不同；（4）产物的不稳定性；（5）与时间有关的过程行为。
21、pH对弱电解质的萃取效率有何影响？
答：
水相pH值决定了蛋白质表面电荷的状态，从而对萃取过程造成影响。
只有当反胶束内表面电荷与蛋白质表面电荷相反时，两者产生静电引力，蛋白质才可以进入反胶束。
对于阳离子表面活性剂，溶液pH>pl时，反胶束萃取才能进行。
对于阴离子表面活性剂，当pH>pl时，萃取率几乎为零，当pH22、发酵液乳化现象是如何产生的？
对分离纯化产生何影响?
如何有效消除乳化现象？
答：
1、乳化现象是一种液体以极微小液滴均匀地分散在互不相容的另一种液体中而产生的。
2、在液—液萃取过程中两相界面产的生乳化现象，对萃取过程的进行是不利的。
即使采用离心机也很难将两相完全分离，若萃取废液中夹带溶剂，收率会相应降低，经萃取的溶剂中夹带发酵液也会给以后的精制造成困难。
3、消除乳化现象方法有：
过滤或离心分离、化学法、物理法、顶转法。
最好采用预处理手段，将发酵液中的表面活性物质除去，消除水相乳化的起因。
24、影响反胶束萃取蛋白质的因素有哪些？
答：
蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关，所以任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。
影响反胶束萃取蛋白质的主要因素，见下表，只要通过对这些因素进行系统的研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目标蛋白质萃取率，从而达到分离纯化的目的。
25、什么是沉淀法，具体包括哪些方法？
答：
1）利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。
2）根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：
（1）盐析法；
（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等；（7）亲和沉淀法；（8）选择性沉淀法。
26、盐析的机理是什么？
答：
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。
（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
27、影响盐析的因素有哪些？
答：
（1）pH值：
一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。
为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目的蛋白的等电点处。
（2）在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。
但在高浓度下，蛋白质溶解度随温度上升而下降。
（3）沉淀蛋白质盐的浓度和起始浓度有关。
高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。
在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。
28、有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？
答、
（1）降低溶剂介电常数（介电常数D有机（2）破坏水化膜：
由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。
（3）相反力：
疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。
30、简述HIC的工作原理？
答：
HIC，疏水作用色层分离法，利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法。
用碳链长度依次变化的同系列的烷基琼脂糖SephCn（n=1-6）分别装柱，在相同条下将混合蛋白质溶液通入柱中，不同蛋白质将在烷基琼脂系列柱中显示不同吸附特性，蛋白质的分辨能力取决于碳链的长度，因此可利用系列柱实验来调节己知蛋白质的吸附强弱，然后用缓冲液进行洗脱。
31、简述凝胶电泳的原理
答：
在凝胶电泳过程中，不同分子量的电荷溶质在迁移过程中的泳动速度是不同的。
相对分子量较大的溶质受凝胶阻滞作用较大，泳动速度慢；分子量小的溶质泳动速度较快。
经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条不同溶质的区带，实现溶质间的分离。
凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液中溶质的相对分子量而异。
凝胶电泳的特点是凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一。
32、常用的凝胶电泳技术有哪些？
答：
根据凝胶电泳的支持介质，分为聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
（1）聚丙烯酰胺凝胶：
由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成；
（2）琼脂糖凝胶：
从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1,3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的。
33、聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程
答、
（1）制胶：
确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；
（2）样品准备：
选
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