实验总结细胞培养方法.docx

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实验总结细胞培养方法

一、培养细胞常用配置

培养基的配置：

基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml

冻存液的配置：

10%DMSO+90%胎牛血清

依次比例酌量配置。

超净工作台常规配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，

常规耗材：

培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管

所需试剂：

培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

实验前准备：

所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。

培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复

步骤：

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

超净台准备一支15ml离心管备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。

4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。

6.取出2个培养皿并做好标记（复日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿。

7.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

8.将培养瓶放入培养箱培养

注意事项：

1.取细胞的过程中注意带好防冻手套。

此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2.冻存液的问题：

冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min使冻存液完全融化。

如果复温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3.离心前须加入少量培养液。

细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4.离心问题：

目前主要有两种见解。

一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。

因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。

此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。

另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。

5.冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液

6.复细胞分装的问题：

复1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7.加培养基的量放入问题：

这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。

所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度

8.原理：

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。

在缓慢的冻结条件下，能使细胞水份在冻结前透出细胞。

贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

三、培养液的更换

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。

4.将培养皿盖口朝上放在架子上，将培养皿的培养液悬空倒进污缸

5．拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次后盖上。

6.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

7.将培养瓶放入培养箱培养

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。

四、细胞传代

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养皿盖口朝上放在架子上，将培养皿的培养液悬空倒进污缸。

取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿。

5.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。

（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。

用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。

8.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基皿吸取5-10ml培养基悬空移入每个培养皿，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次盖上，在皿盖上做好实验标记。

9.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

10.将培养瓶放入培养箱培养。

注意整个培养箱底托盘一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。

五、细胞株的保存

原理：

细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。

细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。

如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代障碍。

胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞容物丢失。

如果细胞冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞水分，减少细胞冰晶的形成。

采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。

慢速冷冻方法又可使细胞的水分渗出细胞外，减少胞形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

实验步骤：

选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。

将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。

适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。

用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。

悬浮生产细胞则不要消化处理。

然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min，10分钟）。

加入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。

取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶。

5.将培养皿盖口朝上放在架子上，将培养皿的培养液悬空倒进污缸。

取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿。

6.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。

（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。

用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.将悬浮细胞吸入15ml离心管，加入4ml培养基离心1000r/min，5min

8.预先配制冻存液：

10%DMSO+90%胎牛血清。

按需要配置一定数量备用

9.弃去培养基，用冻存液进行重悬混匀后，将1ml含有细胞的冻存液移入冻存管，拧紧瓶盖，做好实验标记。

10.将培养基，胰酶瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

8.将冻存管先放于4℃冰箱30min后拿出放置-20℃冰箱过夜，次日再放于-80℃的冰箱3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌长期保存。

或直接放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱过夜后最后存放于液氮罐。

（梯度降温盒为甲醇，使用5次需要更换，每次使用需做好标记，使用前需恢复常温）

六、细胞转染

RNA干扰（RNAinterference,RNAi）:

●是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默（TGS）和转录后水平的基因沉默（PTGS）两类:

TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常录;

●PTGS是启动了细胞质靶mRNA序列特异性的降解机制。

有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

●由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

●病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。

宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。

作用机制

1）其胞质中的核酸切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNA。

2）siRNA在细胞RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体一些酶（包括切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。

3）RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。

被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

4）siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

5）RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞。

需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。

所以正常机体各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

脂质体转染原理：

1.脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。

最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体 

2.阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体其中一小部分DNA能从包涵体释放，并进入细胞质中，再进一步进入核转录、表达

DNA转染步骤

1.转染前一天接种细胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到90-95%每孔。

2.转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3.A液：

DNA5ug加入245ulOpti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。

4.B液：

脂质体使用前轻轻混匀，脂质体10ul加入245ulOpti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5.B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6.将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7.孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。

8.第二天看细胞状态来决定是否换液。

9.同时设立细胞对照组，空白转染组。

siRNA转染步骤

1）转染前一天接种细胞于6孔板（40x104），2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到50-60%每孔。

2）转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3）A液：

siRNA5ul（共100pmol）加入245ulOpti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。

（siRNA按照说明书稀释）

4）B液：

脂质体（RNAimax）使用前轻轻混匀，脂质体10ul加入245ulOpti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5）B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6）将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7）孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。

8）第二天看细胞状态来决定是否换液。

9）同时设立细胞对照组，空白转染组。

使用RNAiMAX和AGScell用于siRNA在6孔板上进行转染实验

1）提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀释液，取附赠的DEPC水至管，打开离心管前先离心，将附在管壁上的冻干粉离心下来

2）溶解时滴加适量的DEPC水后盖上管盖，震荡溶解：

NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ulDEPC水

3）取6只EP管，分别标记GAPDH，NC，NV-FAM，三个片段名称，从管吸取20ul的稀释液分装后

4）将稀释液至于-80度冰箱保存。

●转染前一天，在6孔板上接种40x104AGScell，再取一个35mm培养皿接种40x104AGScell，每孔放2ml不含抗生素的生长培养基。

使细胞在转染的时候有50-60%的融合率

●从细胞中除去生长培养基

●每个孔中加入1.5ml新鲜不含血清的培养基，并准备如下混合物

1）A液：

（取7个EP管，分别标记空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三个片段）。

在250ul的opti-mem终加入100pmolsiRNA（稀释好的siRNA浓度为20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均匀

2）B液：

（取一个EP管标记RNAiMAX），RNAiMAX使用前摇匀，在250ulX7.2=1800ul的opti-mem加入6ulX7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀释RNAiMAX混匀后并在室温下温育5min

3）混合A液和B液，混匀B液后吸取256ul至A液中室温下温育20min

●将混合物混匀后加入到含AGS的6孔板与35mm培养皿中，每孔终体积为2ml，则加入混合液500ul，并轻摇混匀

●在37℃的二氧化碳培养箱中培养5-6小时

●更换含血清的培养基并培养细胞24-48小时

24-48小时后收细胞跑WB，看沉默效果