BMP异位诱导成骨的MicroCT评判.docx

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BMP异位诱导成骨的MicroCT评判

BMP异位诱导成骨的Micro-CT评判

李丹　刘民，胡蕴玉，毕龙，段永红，金静，王军，刘山金

【摘要】借助Micro-CT评判单纯牛骨形态发生蛋白（bovinebonemorphogeneticprotein，bBMP）异位诱导成骨的长期三维影像学及骨质转变。

（20±2）g昆明小鼠21只，麻醉后于双侧股部肌肉中植入bBMP各2mg，别离于一、二、4、六、八、10、12周遍地死3只，切取诱导分化组织，5%戊二醛固定，行Micro-CT扫描和三维重建，运用ABA专用骨骼分析软件测定组织矿含量（tissuemineralcontent,TMC），组织骨密度（tissuemineraldensity,TMD），骨体积分数（bonevolumefraction,BVF），结构模型指数（structuremodelindex,SMI）,骨小梁厚度（trabecularthickness,,骨小梁数量（trabecularnumber,及皮质骨骨密度（bonemineraldensity,BMD）等参数，运用统计软件进行统计学分析。

bBMP从植入2周开始慢慢形成一椭圆形骨组织块，2～4周，异位生成骨呈疏松的新生骨，4周时组织矿含量达第一个峰值，骨小梁数量最多;随着观看时刻的延长（6～12周），异位诱导生成的椭圆形骨组织内部骨小梁慢慢吸收，数量减少，12周时骨小梁数量最少;而外层骨组织慢慢塑形成为皮质骨，12周时骨矿含量值、骨小梁厚度、组织骨密度和皮质骨骨密度均达最大值。

说明bBMP具有壮大的异位骨诱导能力，血供不足时，骨质降解吸收;血供充沛时，骨质慢慢成熟改建。

【关键词】骨形态发生蛋白;异位成骨;骨诱导;骨小梁;MicroCT

　　Abstract：

Toassessthe3-DimageandchangesinqualityofosustissueproducedthroughectopicosteoinductionbybovinebonemorphegeneticproteinoveranextendedperiodbymeansofKunmingrats（20±2）gwereused，2mgbBMPwereimplantedintothighmusclesofbothsidesoftheratunderanesthesia.Threeanimalsofeachweresacrificedat1,2,4,6,8,10and12weeksaftertheimplantation.Afterbeingharvested,thenewlyformedbonetissuewasfixedwith5%glutaraldehyde,thensuccessivelysubjectedtoMicro-CTscanand3-Dreconstruction,measurementoftissuemineralconsent（TMC）usingABAsoftwareandtissuemineraldensity（TMD）,determinationofbonevolumefraction（BVF）,structuremodelindex（SMI）,trabecularthickness,trabecularnumber,corticalbonemineraldensity（BMD）andotherparameters,3-DimageswerecreatedandsavedasTIFFfiles;statisticalanalyseswerecarriedoutbyANOVA（analysisofvariance）usingStatisticsPackageforSocialScience（SPSS）2weekspostimplantation,anovalmassofosustissuebegantotakeshape;between2to4weeks,theectopic-inducednewbonepresentedasloosecancellousbonetissue,andthemineralcontentreachedthefirstpeakbythe4thweek,showingnumeroustrabeculae;theinnermosttrabecularoftheectopic-inducedlumpofosustissuewereresorbedwiththeirnumberdecreasedwithtime（between6thand12thweek）,approachingtheminimumbythe12thweek;theouterpartremodeledintocorticalbonewithTMC,,TMDandBMDofthelumpaswholereachingthemaximumbythe12thBMPpossessesstrongectopicosteoinductivity,butthenewlyformedbonetissueisresorbedwhenthebloodsupplyisinadequate,whereastheosustissueremodelswithprogressiontowardamaturetissuewhenprovidedwithamplebloodsupply.

　　Keywords：

Bovinebonemorphogeneticprotein;Ectopicboneformation;Osteoinduction;Trabecularbone;Microcomputedtomography

　　1引言

　　自1965年Urist[1]第一次报导骨形态发生蛋白异位成骨能力到1995年中国食物药品监督治理局对重组合异种骨[2]（要紧成份为bBMP）及美国FDA接踵对rhBMP临床应用的批准，BMP的研究已从实验室走向临床。

可是，关于BMP仍有许多未解决的问题，例如BMP活性定量，BMP异位成骨的转归等。

目前，研究要紧集中在基因重组的BMP，如rhBMP-二、rhBMP-4及rhBMP-7等，反而轻忽对最先通过生物化学方式提取并纯化的天然BMP的研究。

既然BMP具有壮大的异位骨诱导成骨能力，这种异位生成骨是不是具有应用价值?

其转归如何?

本实验就小牛骨中生物提取BMP异位成骨进程中组织学的转变进行长期观看，借助MicroCT了解成骨骨质转变情形，探讨这种异位生成骨进一步应用的可能性，并为BMP相关骨修复研究提供参考。

　2材料与方式

　　原材料与设备

　　bBMP（本研究所综合骨库制备），昆明小鼠（第四军医大学实验动物中心提供），速眠新（长春军事兽医研究所），eXploreLocusSP型Micro-CT（美国GE公司）,Micview三维重建处置软件，ABA专用骨骼分析软件。

　　植入实验

　　（20±2）g昆明小鼠21只，麻醉后于双侧股部肌肉中植入bBMP各2mg，别离于一、二、4、六、八、10、12周遍地死3只，切取诱导分化组织，5%戊二醛固定。

　　标本扫描

　　扫描协仪：

44mltube21um150minss

　　扫描参数：

扫描分辨率21μm，旋转角度360°，旋转角度增量°，电压80kV，电流80μA，曝光时刻3000ms，帧平均数为4，像素组合为1×1。

　　三维重建

　　扫描完成后，运用Micview软件进行三维重建处置。

　　分析测试

　　ABA专用骨骼分析软件分析测试以下参数：

TMC，TMD，BVF，SMI，，及皮质骨BMD。

　　统计学分析

　　测试数据表示为均数±标准差，用SPSS统计软件处置，所有数据先行散布正态性分析和方差齐性查验，对多组均数的比较采纳单因素方差分析，两组间比较采纳t查验，P<。

　　3结果

　　MicroCT影像学

　　如图1（截取任一平面MicroCT扫描图）所示，除bBMP植入1周时尚无放射性显影外，从2周开始均有较强的放射线显影，诱导分化的组织呈椭圆状，从4周开始，椭圆形组织块内部显影的骨小梁数量慢慢减少。

表面重建影像学结果见图2，2周和4周时，组织块表面呈疏松的蜂窝状，6周开始至12周

　　分析测试结果

　　组织矿含量（TMC）测定结果显示，在2周到4周及10周到12周两个时刻段，组织矿含量有一个加速增加的进程，4周到8周趋于平稳而略有下降，8周到10周那么缓慢上升（见图4A），除10周与6周外，其他任何两组间比较均有显著统计学意义;组织骨密度（TMD）测定结果显示，从2周到8周，TMD呈缓慢上升趋势，从8周开始到10周加速上升（见图4B），除10周与12周外，其余各组间比较均有统计学意义;骨体积分数（BVF）整体呈现下降趋势（见图4C），但转变不明显，两组间仅2周和12周比较具有统计学意义;结构模型指数（SMI）测定结果显示，2周到4周时刻段，SMI下降，4周到6周，SMI上升，而从6周开始至12周，SMI持续下降（见图4D），除2周与6周，4周与10和12周外，其余组间比较均有统计学意义;骨小梁厚度测定结果显示，2周到4周和10周到12周时刻段，骨小梁厚度转变平稳，组间比较无统计学意义，从4周到10周呈加速变宽，组间比较均有显著统计学意义（见图4E）;骨小梁数量在4周时最大，且从此加速下降，至8周趋于平稳（见图4F），除2周外，4周与其他各组比较均具有显著统计学意义，而六、八、10及12周两两比较均无统计学意义;皮质骨骨密度（BMD）测定结果显示，2周到8周，各组间比较无统计学意义，皮质骨骨密度无明显转变，从8周开始到10周时刻段快速增加（见图4G），二、4、6及8周与10和12周比较均有统计学意义。

不同时刻点各参数值见表1。

　　4讨论

　　寻觅理想的骨移植替代物始终是骨移植与骨修复研究领域的热点课题。

即便临床已经应用的替代物如自体骨、异体骨及各类人工骨和一些初步临床应用的个体化设计的组织工程骨均不同程度存在诸如取骨量有限、存在潜在病毒感染、免疫排斥反映、新骨形成和材料降解不匹配等诸多问题。

因此，有学者开始考虑可否利用BMP异位骨诱导作用将异位生成骨用于骨移植[3-5]。

Kusumoto等[6]以I型胶原为rhBMP-2载体在Wistar大鼠肌肉中异位预制了血管化的骨组织，Inoda等[7]以胶原海绵为rhBMP-2载体于Wistar大鼠肌肉中异位构建骨组织，3周时用于修复骨缺损，并与自体骨，异体骨进行了比较，实验结果令人中意。

但是Cooley等[8]对rhBMP-2异位成骨进行的长期观看研究说明，这种皮下或肌肉内注射rhBMP-2所诱导生成的异位骨与在骨性组织中长期存在的新生骨不同，异位成骨是短时间成骨，异位新生骨会发生吸收，在4周时完全丧失钙化特点，在其设计的9组实验中，除4组皮瓣组外，其它5组新生骨在4～5周时均全数消失。

　　本实验直接将从小牛皮质骨中提取的天然BMP（二次纯化离心所得的块状沉淀2mg）未加任何载体，单独植入小鼠股部肌肉中，MicroCT三维重建发觉，除bBMP植入1周时尚无放射性显影外，从2周开始均有较强的放射线显影，诱导分化的组织呈椭圆状，2周到4周时，组织块表面呈疏松的蜂窝状，6周开始至12周那么慢慢滑腻致密，皮质骨骨密度自2周慢慢增加至12周时最高，专门好地印证了影像学所见，与Cooley等所观看到的rhBMP异位生成骨在4～5周时全数消失不同，bBMP所诱导的异位生成骨4周后仍存活并在改建中。

表1不同时刻点各参数值

　　三维重建图像显示，二、4、6周时异位新生骨以疏松的骨小梁形成椭圆形组织块，后期那么内部骨小梁数量慢慢减少，外部钙化增强，骨质改建，与检测取得的组织矿含量（TMC）和组织骨密度（TMD）整体均呈上升趋势及骨小梁数量慢慢下降的结果相吻合;骨体积分数（BVF）即骨体积占整体积的比例在本组实验中也呈下降趋势，从另一个侧面证明了骨小梁数量的减少;结构模型指数（SMI）是通过计算骨骼表面的曲率来描述骨小梁板状和杆状的程度的指数，理想的板状骨小梁和杆状骨小梁的SMI数值别离为0和3，发生骨质疏松时，骨小梁从板状向杆状转变，SMI数值增加[9]。

本组实验中，SMI值在6周时为最高约，在12周时为最低约，即6周时骨小梁接近杆状，而12周时接近板状，骨质明显改建;本组实验中骨小梁平均厚度持续增加那么加倍充分地说明了骨小梁的进一步改建。

　　Seiya等[10]以βTCP作为rhBMP-2载体在体内肌肉中异位构建血管化的自体骨，结果说明，血管化在异位骨的形成和维持中起着相当重要的作用。

本实验直接异位植入块状bBMP，诱导形成的椭圆形组织块外周被肌肉所包绕，有着丰硕的血供，骨质未见明显吸收，而组织块内部，由于没有载体支架，血管长入困难，血供差，部份骨小梁慢慢吸收降解，提示血供在异位骨的形成和维持中可能起着重要作用，后续实验应将进一步探讨血管化和血供在bBMP异位成骨中的作用。

　　bBMP无需任何载体即可在肌肉中异位成骨，本实验椭圆形异位骨组织块内骨小梁在4周以后开始吸收减少，但内部残余骨小梁和外层骨质不仅持续存活，而且，骨质进一步塑形改建，提示bBMP异位生成骨存在潜在的应用价值。

【参考文献】

　[1]UristMR.Boneformationbyautoinduction[J].Science,1965，150（698）：

893-899.

　　[2]胡蕴玉，陆裕朴，刘玮.重组合异种骨的实验研究与临床应用[J].中华外科杂志，1993;31：

709-712.

　　[3]於丽明，王佐林.BMP2诱导骨骼肌成骨的研究进展[J].口腔颌面外科杂志,2020,18（4）:

300-303.

　　[4]KazuyaYoshida，KazuhisaBessho，KazumaFujimura，etcapabilityofrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2inintramuscularandsubcutaneoussites:

anexperimentalstudy[J].JournalofCranio-MaxillofacialSurgery,1998,26:

112-115.

　　[5]KanczlerJM,GintyPJ,BarryJA,etal.Theeffectofmesenchymalpopulationsandvascularendothelialgrowthfactordeliveredfrombiodegradablepolymerscaffoldsonboneformation[J].Biomaterials,2020,29:

1892-1900.

　　[6]KusumotoK,BesshoK,FujimuraK,etal.Prefabricatedmuscleflapincludingboneinducedbyrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2:

anexperimentalstudyofectopicosteoinductioninaratlatissimusdorsimuscleflap[J].BritishJournalofPlasticSurgery,1998,51:

275-280.

　　[7]InodaH，YanmmotoG，Hattoriinducedectopicboneforgraftingcriticalsizedefects：

apreliminaryhistologicalevaluationinratcalvariae[J].IntJOralMaxillofacSurg,2007,36

（1）:

39-44.

　　[8]CooleyBC，DaleyRA，TothBMP-2inducedboneformationinratislandandfreeflaps[J].Microsurgery,2005,25

（2）:

167-173.

　　[9]HildebrandT,RuegseggerP.Quantificationofbonemicroarchitecturewiththestructuremodelindex[J].CompMethBiomechMiomedEng，1997;1:

15-23.

　　[10]SeiyaJingushi,KenUrabe,KenOkazaki,etal.Intramuscularboneinductionbyhumanrecombinantbonemorphogeneticprotein-2withbeta-tricalciumphosphateasacarrier:

invivobonebankingformuscle-pedicleautograft[J].JOrthopSci,2002,7:

490-494.