PGM测序方法protocol.docx

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PGM测序方法protocol

314芯片测序方法

文库构建：

PCR扩增基因组DNA的目标区域

1.选择下方合适的表格是基于用户选择的是2x的引物池还是5x的引物池。

对每一个DNA和引物池的混合，将以下组分加入PCR管内。

以下表格提供了包含和未包含IonAmpliSeq™SampleIDPanel的反应体系。

对多个反应可准备配置混合溶液。

2X引物池（Cat.nos.4477685,4477686,andcustompanels）

成分

不包含IDpanel（ul）

包含IDpanel（ul）

5XIonAmpliSeq™HiFiMix

4

4

2XIonAmpliSeq™PrimerPool

10

10

可选:

20XIonAmpliSeq™SampleIDPanel

--

1

gDNA,10ng

Y

Y

Nuclease-freeWater

6-Y

5-Y

总体积

20

20

5X引物池（Cat.nos.4471262and4475346）

成分

不包含IDpanel（ul）

包含IDpanel（ul）

5XIonAmpliSeq™HiFiMix

4

4

5XIonAmpliSeq™PrimerPool

4

4

可选:

20XIonAmpliSeq™SampleIDPanel

--

1

gDNA,10ng

Y

Y

Nuclease-freeWater

12-Y

11-Y

总体积

20

20

2.充分震荡，简单离心。

3.将PCR管置于PCR仪内，运行一下程序以扩增基因组上目标区域。

阶段

步骤

温度

时间

持续

酶活化

99℃

2分钟

循环数（根据下表格设置）

变性

99℃

15秒

退火/延伸

60℃

4/8/16*分钟

持续

--

10℃

持续+

*4分钟是对≤1536对引物池；8分钟是对1537-6144对引物池；16分钟是对6145-24576对引物池。

+PCR产物可置于10℃过夜储存。

引物对数目

循环数

标准DNA

石蜡包埋DNA

12-24

21

24

25-48

20

23

49-96

19

22

97-192

18

21

193-384

17

20

385-768

16

19

769-1536

15

18

1537-3072

14

17

3073-6144

13

16

6145-12288

12

15

12289-24576

11

14

注意：

Ready‐to‐usepanels:

当加入IonAmpliSeq™SampleIDpanel时不需要调整循环数。

Customprimerpools：

如果一个custom设计的panel中包含两个引物池，并分别落在不同的循环数分类中，请选用更大的循环数来扩增这两个引物池。

一般标准样品可以增加一个循环，从而保证其扩增效率，石蜡切片样品可增加2-3个循环。

如果引物池有两管及以上，应当分别扩增（10μl体系）。

扩增完后混合取20μl进行下轮实验。

暂停点–PCR产物可以储存在10°C过夜，需要更长时间储存，可以置于–20°C.

部分消化引物序列

1.轻度离心PCR管将反应后溶液收集到管底。

往每个混合反应液中加入2微升FuPa Reagent ，总体系达到22微升。

2.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。

（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）

3.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。

温度

时间

50℃

10分钟

55℃

10分钟

60℃

20分钟

10℃

持续（最长至1小时）

将接头连接至扩增产物并纯化

配置并运行连接反应

1.如果有可见的沉淀物在Switch溶液中，通过室温下震荡或上下吹吸来溶解并重悬。

2.小心PCR管加入以下成分到每个反应孔内消化样本。

在加入之前可先混合Switch溶液和接头。

成分

体积（μL）

SwitchSolution

4

稀释的barcode接头混合物

2

总体积

28

3.在每个PCR管内加入2微升DNA连接酶。

4.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。

（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）

5.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。

温度

时间

22℃

30分钟

72℃

10分钟

10℃

持续（最长至1小时）

暂停点–产物可以置于–20°C保存。

纯化未扩增的文库

使用Agencourt®AMPure®XP试剂1.5x样本体积

重要事项!

–将AMPure® XP reagent 置于室温并充分振荡将磁珠混匀，使用时缓慢吸取.接下来的步骤需要使用新鲜配置的70%乙醇。

对每个样品，混合230微升无水乙醇和100微升无核酶水。

1.将加完接头的文库转移至1.5ml离心管内，加入45微升（1.5x样本体积）的Agencourt®AMPure®XP试剂。

用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀。

2.将混合液置于室温5分钟。

3.将1.5ml离心管置于DynaMag™‐96 Side Magnet （Cat. no. 12331D）磁力架上，静置2分钟或者等溶液变清澈。

小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠。

4.向离心管中加入150μL新鲜配制的70%乙醇，在磁力上来回移动1.5ml离心管来洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动磁珠。

5.重复第4步，进行第二次洗涤。

6.确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。

将1.5ml离心管放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。

7.将1.5ml离心管从磁力架上拿开，在每管中加入50μLLowTE充分浸润磁珠。

充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。

（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）

8.将1.5ml离心管置于磁力架上2分钟。

上清液中含有文库。

文库扩增：

1.将1.5mlEP管从磁力架上取下，加50μlPlatinum® PCR SuperMix High Fidelity和2 μlof Library Amplification Primer Mix。

Platinum®PCRSuperMixHighFidelity和LibraryAmplificationPrimerMix需要事先混合好。

充分漩涡震荡后简单离心，或者用枪上下吹吸5次。

2.将1.5mlEP管放在磁力架上至少2分钟，将上清约50μl转移到一个干净的200μLPCR内。

3.运行一下PCR程序

纯化扩增后的文库

第一轮纯化

1.加入25μl（0.5X的样品体积） Agencourt® AMPure® XP Reagent到每个样品管中，用移液枪吹吸5次。

2.室温下静置5分钟。

3.将样品管放在磁力架上至少5分钟，直至溶液变澄清。

4.小心的将上清移入另一个干净的PCR管中。

第二轮纯化

1.在第一轮纯化取到的上清中加入60μlAgencourt® AMPure® XP Reagent，用枪头反复吹吸5次

2.室温下静置5分钟。

3.将样品管放在磁力架上至少3分钟，直至溶液变澄清，将上清吸除。

4.加入150μl新鲜配置的70%的酒精，缓慢旋转两圈，将上清吸除。

5.重复步骤4

6.确保酒精完全被移除，打开管盖，常温干燥5分钟。

7.将样品管从磁力架上取下，加入50μl LowTE，充分漩涡震荡，简单离心，或将移液枪调至40μl 吹吸5次。

8.将样品管放入磁力架后，静置两分钟，将上清转移到新的1.5ml离心管。

Qubit定量

1.制备 Qubit® dsDNA HS reagent稀释液：

1μlQubit® dsDNA HS reagent加199μl Qubit® dsDNA HS Buffer。

2.在10μL 的 amplified Ion AmpliSeq™ library 中加入190μL 的dye reagent，混合充分后静置2分钟。

3.1μL样品中加入199μLdyereagent进行测样。

定量完成后，不同引物的相同样品的管合为一管（相同浓度）每管定到300PM，混合后能达到100PM。

IonPGM200bp自动模本制备

在IonOneTouch2instrument上制备模板ISP

1.4.1IonOneTouch2仪器准备

1.4.1.1打开IonOneTouch2背面的电源开关；按触摸屏上OPENLID，等待离心机盖打开；

1.4.1.2参照图1将RecoveryTubes（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）放置于IonOneTouch2离心收集器的转子中,随后将RecoveryRouters（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）放置于相应位置，手动盖上离心机盖；

图1

1.4.1.3参照图2顺序将IonOneTouch™2AmplificationPlate（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）放置于加热模块中，将加热模块手柄压向自己身体方向，盖上IonOneTouch™Lid，导管固定于上端的卡口和正面右上角的支架上，将AmplificationPlate的注射针垂直插入IonOneTouch™DLInjectorHub，直至接触到底部的RecoveryRouter，然后松开注射针

图2

6

5

4c

4b

4a

3

1

2

1.4.1.4IonOneTouch™Oil和IonPGMOT2RecoverySolution添加

1.4.1.4.1每次开始使用新的IonPGM™TemplateOT2200Kit，丢弃掉前一个试剂盒使用的IonOneTouch™Sipper和IonOneTouch™Tubes，戴上新的乳胶手套，装上新的IonOneTouch™Sipper；将IonOneTouch™Oil瓶（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）上下颠倒10次，倒入任意一个新的IonOneTouch™Tube中，约1/2满，安装至标示有

的下方相应位置拧紧；IonPGMOT2RecoverySolution（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）倒入另一个新的IonOneTouch™Tube中，约1/3满，安装至标示有

的下方相应位置拧紧；

1.4.1.4.2同一个IonPGM™TemplateOT2200Kit的后续使用准备时，将IonOneTouch™Oil（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）瓶上下颠倒10次，取下有IonOneTouch™Oil的IonOneTouch™Tube，剧烈混匀至产生微小的气泡（图3），加入IonOneTouch™Oil，约1/2满，安装至标示有

的下方相应位置拧紧；将IonPGMOT2RecoverySolution（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）倒入另一个的含有IonPGMOT2RecoverySolution的IonOneTouch™Tube中，约1/3满，安装至标示有

的下方相应位置拧紧；

图3

1.4.2IonOneTouch反应液相准备及上机

1.4.2.1按照如下表格顺序室温配置体系，试剂来自IonPGMTMTemplateOT2Reagents200

顺序

试剂

管盖颜色

体积（ul）

处理方式及状态

1

Nuclease-FreeWater

——

25

——

2

IonPGM™TemplateOT2200ReagentMix

紫色

500

提前室温放置，充分溶解至无沉淀，漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于4℃

3

IonPGM™TemplateOT2200PCRReagentB

蓝色

300

充分溶解至无沉淀，漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于室温

4

IonPGM™TemplateOT2200EnzymeMix

褐色

50

短暂离心后，冰上放置

5

测序用文库

——

25

将定量好的文库稀释至15ng/ml,取2ul稀释到25ul

——

Total

——

900

——

1.4.2.2将上述体系涡旋震荡5s，稍离心；

1.4.2.3将IonPGM™TemplateOT2200IonSphere™Particles最大速漩涡混匀1min，上下吸打5次后，吸取100ul，加入6.4.2.1的液相体系中，上下吸打混匀，室温放置备用；

1.4.2.4将IonPGMOneTouch™PlusReactionFilter（IonPGMTMTemplateOT2Reactions200）置于15ml离心管上（图4），将6.4.2.3种配制好的液相体系漩涡混匀5s，短暂离心2s；用1000ul移液器将所有的液相缓慢从距离另外两个孔较远的样品孔（图4）注入reactionfilter，注意移液头与样品孔紧密接触插紧；

图4

1.4.2.5用1000ul移液器从此孔缓慢加入1000ulIonOneTouch™ReactionOil（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200），更换一个新的1000ulUniversalFitFilterTip移液头（防止交叉污染），再缓慢加入500ulIonOneTouch™ReactionOil；

1.4.2.6如图5，将加样孔置于左侧，顺时针倒转reactionfilter，避免管内导管接触反应液相；

图5

1.4.2.7如图6，将reactionfilter插入IonOneTouch™相应位置，边缘凸起位置朝向自己；

凸起部分

图6

1.4.2.8在系统显示屏上选择RUN（图7）；

图7

1.4.2.9选择IonPGMTMTemplateOT2200kit（图8）

图8

1.4.2.10然后选择Expert,最后点击NEXT开始运行。

1.4.3运行结束及IonOneTouch™清洗

6.4.3.1模板制备程序运行结束，在显示屏上选择两次next键，进入离心程序，约10min；

6.4.3.2将注射针拔出，放入一个空的50mL的管子（图9）；

图9

1.4.3.3打开离心收集器盖，用清洁纸巾将盖子上的液体擦拭干净，拿掉RecoveryRouter，小心缓慢将RecoveryTubes取出放于板架上，模板ISP位于RecoveryTubes底部外侧（图10）

图10

1.4.3.4拿掉ReactionFilter，将CleaningAdapter（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）凸出部分面向自己插入相应位置（图11）

图11

1.4.3.5选择next键退出离心程序，回到主界面，在屏幕上选择Clear，

1.4.3.6根据提示选择next，直至程序运行，运行时间约10min

1.4.3.7清洗结束后取下AmplificationPlate和废液管一起扔进专门的垃圾桶，关闭电源

IonOneTouchTMES的操作及阳性模板富集

1.5.1沿远离沉淀一侧，自液面开始小心将两管RecoveryTubes中的上清液吸掉，各剩余约50uL；

1.5.2取一个新的1.5mL的Non-StickTube，将RecoveryTubes中剩余50uL液体吹打10次后吸入其中；

1.5.3在两管RecoveryTubes中各加入100uLWashSolution（IonOneTouch™200SolutionsKitv2），吹打混匀后，吸入6.4.2的1.5mLNon-StickTube中；

1.5.4在6.5.3的1.5mLNon-StickTubes中再加入1000uL200uLWashSolution，最大转速漩涡振荡10s混匀，15500g离心3min；

1.5.5沿远离沉淀一侧，自液面开始小心吸掉上清液，剩余100uL在管底，低速漩涡振荡10s混匀；

1.5.6配制好新鲜的1MNaOH（1MNaOH最长可在一周内使用）；

取一个1.5mL普通离心管，按如下表格配制Melt-OffSolution（每次新鲜配制）

顺序

试剂

体积（ul）

1

Tweensolution（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）

280

2

1MNaOH

40

Total

320

1.5.7吸取130uLMyOne™BeadsWashSolution到一个新的1.5mL的Non-StickTube中；将Dynabeads®MyOne™StreptavidinC1Beads最大转速漩涡震荡30s，取13.0uL到上述1.5mL的Non-StickTube，漩涡振荡混匀30s，短暂离心2s；

1.5.8将6.5.7的离心管置于DynaMag™-2magnet上2min或至溶液澄清，小心吸掉上清，避免碰触沉淀；将离心管从DynaMag™-2magnet上取下，吸取130uLMyOne™BeadsWashSolution到离心管中，漩涡振荡悬浮Dynabeads®MyOne™StreptavidinC1Beads；

圆头

方头

1.5.9取一个8-wellstrip（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200），方头永远放在面朝自己的左面，从左到右依次编号为1到8（图12）；

图12

1.5.10按如下表格在8-wellstrip中加入相应试剂（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）

孔编号

对应孔试剂

1（方头第一个）

6.5.5中的100ul模板ISP（U）

2

6.5.8中130ulDynabeads®MyOne™StreptavidinC1Beads（B）

3

300uLIonOneTouch™WashSolution（W）

4

300uLIonOneTouch™WashSolution（W）

5

300uLIonOneTouch™WashSolution（W）

6

空

7

吸取300uL6.5.6中新鲜配制的Melt-Offsolution（M）

8

空

1.5.11将8-wellstrip放入IonOneTouch™ES前方白色模块中的凹槽中，方头在左，紧靠在凹槽右侧；

1.5.12取一个新的Tip（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）放入TipLoader

中，从支架上取下TipArm插入TipLoader中，用力向下按紧1s，松开，取下TipArm放回支架上（一定要放到位），新的Tip已装在TipArm下方（图13）；

图13

1.5.13在TipArm下方的洞中放一个开口的0.2ml的PCR管,里面加入NeutralizationSolution10ul（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）；

1.5.14打开IonOneTouch™ES电源，按Start/Stop键，运行过程中显示屏上一直显示“run”，IonOneTouch™ES自动开始阳性模板富集；

1.5.15富集过程结束是，IonOneTouch™ES会有蜂鸣提示，并且显示屏显示“End”，整个过程约40min；

1.5.16结束后，将用过的Tip取下，和8-wellstrip一起扔进专门的垃圾桶，关闭电源

1.5.17取出0.2mLPCR管扣上盖子，15500g离心3min；

1.5.18沿远离沉淀一侧，从液面开始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；

1.5.19加入200uLIonOneTouch™WashSolution，上下吹打混匀10次，15500g离心3min,沿远离沉淀一侧，从液面开始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；

1.5.20加入100uLIonOneTouch™WashSolution，上下吹打混匀10次，若不立即进行后续的测序，可置于4℃保存2-3天。

IonPGM200bp读长上机测序操作

PGM的清洗

1.2.1氯片清洗（如果PGM超过48个小时未使用，请首先用氯片清洗）；

1.2.1.1将W1氯片清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次，备用；W1清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次后，加满250ml18MΩ去离子水，备用；

1.2.1.2将1L的容器用每次100ml18MΩ去离子水漂洗3次，装满1L18MΩ去离子水，放入一片PGMCleaningTablet（IonPGM™SequencingSolutions200Kitv2），静置10min；

1.2.1.310min后，加入1ml1MNaOH,混匀（该溶液请在2-3小时之内使用）；

1.2.1.4用0.22μm滤器过滤250ml以上氯片溶液到W1氯片清洗瓶中；

1.2.1.5打开PGM电源，氩气输出气压调至30psi；

1.2.1.6PGM启动完毕后，点击进入Clean菜单，确保芯片座上有一块旧芯片；

1.2.1.7按屏幕提示，勾选Chloritecleaning，点击NEXT；

1.2.1.8通过后按提示将W1氯片清洗瓶拧上W1位（保证有吸管）；

1.2.1.9将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管，清空废液瓶的废液；

1.2.1.10去掉前端四种dNTPs尖底管，不要取下吸管，在吸管下放置废液缸；

1.2.1.11按next，进入清洗程序；

1.2.1.12第一轮清洗结束后，用18MΩ去离子水涮洗W1位的吸管，将含250ml18MΩ去离子水的W1清洗瓶拧上W1位，按next进入第二轮清洗程序；

1.2.1.13第二轮清洗结束，整个PGM清洗结束，可进入初始化步骤；

1.2.218MΩ去离子水清洗（两次初始化之间小于24h）；

1.2.2.1W1清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次后，加满250ml18MΩ去离子水，备用；

1.2.2.2打开PGM电源，氩气输出气压调至30psi；

1.