第四章核酸.docx

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第四章核酸

第四章核酸

第一节概论

⏹一、核酸的发现和研究简史

⏹

（一）核酸的发现

⏹1868年瑞士青年科学家Miescher在外科绷带脓细胞分离得到细胞核，从中提取出一种含磷量很高的酸性化合物称为核素。

⏹1889年Altmann发明了从酵母和动物组织中制备不含蛋白质的核酸的方法。

首次提出了核酸的名称。

⏹1894年Hammars证明了酵母核酸中的糖是戊糖。

⏹1909年Levene年确定戊糖是2-脱氧-D-核糖。

⏹19世纪末~20世纪初Kossel鉴定了碱基。

⏹

（二）核酸的早期研究

⏹Levene“四核苷酸假说”阻碍了核酸的研究。

⏹20世纪40年代，显微紫外分光光度法、组织化学法、亚细胞单位的分离与化学分析法的应用，推翻了“四核苷酸假说”。

⏹（三）DNA双螺旋结构模型结构的建立

⏹早期分子生物学的三个学派：

⏹结构学派：

Astbury用X-射线结晶学技术研究生物大分子的三维结构，并认为研究其起源和功能是分子生物学的主要任务。

⏹信息学派：

Delbruck,Schrodinger、S.Luria认为生命的本质是信息传递的问题：

信息如何被编码？

如何保持其稳定性？

偶然的变异是如何产生的？

⏹生化遗传学派：

用生物化学的方法阐明基因是如何行使功能而控制特定性状的。

⏹1953Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型。

说明了基因的结构、信息和功能三者的关系，使三个学派得到统一，并推动了分子生物学的发展。

⏹1956年Kornberg发现DNA聚合酶。

DNA双螺旋立体结构

⏹1961年JacobMonod提出操纵子学说，并假设了RNA的功能。

⏹1965年Holley测定了酵母丙氨酸RNA的核苷酸序列。

⏹1966年Nirenberg破译了遗传密码。

⏹1970年发现了逆转录酶。

⏹（四）生物技术的兴起

⏹七十年代前期DNA重组技术的建立的基础：

⏹DNA的切割技术—工具酶的发现和应用。

⏹分子克隆—DNA体外重组体的无性繁殖。

⏹1975,1976快速测序—酶法与化学法测序技术的建立。

⏹基因重组技术可应用于改变生物机体的性状特征、改造基因、以至改造物种。

导致了新的生物技术产业群的兴起。

⏹1981年Cech发现了核酶—催化功能。

⏹1983年Simons,Mizuno反义RNA—调节功能。

⏹（五）人类基因组计划开辟了生命科学的新纪元

⏹1990年人类基因组计划实施庞大的人类基因组计划，在经过各国科学家的多年努力，已取得巨大的成就。

十多种低等模式生物的基因组序列测定已完成；

⏹第一个多细胞生物——线虫基因组的DNA全序列测定也在1998年底完成；

⏹人类基因组的全序列提前到2003、4、14完成。

⏹生命科学已进入了后基因组时代，研究重心已从基因测序转移到基因的功能。

⏹功能基因组学

⏹蛋白质组学

⏹结构基因组学

⏹RNA组学

⏹二、核酸的种类和分布

⏹

（一）、类别：

核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）。

⏹核糖核酸（RNA）分成三类：

⏹1、信使RNA（mRNA）：

单链差别较大，其顺序决定蛋白质的氨基酸顺序。

⏹2、转移RNA（tRNA）：

携带氨基酸，核糖体上，每种氨基酸至少有一种tRNA。

⏹3、核糖体RNA（rRNA）：

不稳定，与核蛋白结合。

⏹二、分布：

⏹1、DNA：

⏹原核生物集中于核区.

⏹真核生物细胞核,线粒体、叶绿体亦含有DNA.

⏹原核、真核生物的质粒

⏹病毒含有DNA或RNA.

⏹2、RNA

⏹存在于细胞质和细胞核中。

⏹发现了许多新的具有特殊功能的RNA：

⏹如反义RNA，核酶等.

⏹病毒和亚病毒RNA有许多种：

正链RNA病毒、负链RNA病毒、类病毒、卫星病毒等.

⏹三、核酸的生物功能

⏹

（一）DNA是主要的遗传物质

⏹1、细菌转化实验

⏹2、噬菌体侵染实验

⏹证明了DNA是主要遗传物质

⏹3、有些病毒的遗传物质是RNA.

⏹

（二）RNA参与蛋白质的生物合成

⏹rRNA占细胞总RNA的80%，它是装配者并起催化作用.

⏹tRNA占细胞总RNA的15%，它是转换器，携带氨基酸并起解译作用.

⏹mRNA占细胞总RNA的3~5%，它是信使，携带DNA的遗传信息,并起蛋白质合成的模板作用.

⏹（三）RNA功能的多样性

⏹1、控制蛋白质合成.

⏹2、作用于RNA转录后加工与修饰.

⏹3、基因表达与细胞功能的调节.

⏹4、生物催化与其他细胞持家功能.

⏹5、遗传信息的加工与进化.

第二节核酸的结构

⏹核酸全部磷酸二酯键断裂核苷酸

⏹核苷酸磷酸单酯键断裂核苷+磷酸

⏹核苷糖苷键断裂碱基+核糖

⏹核酸部分磷酸二酯键断裂寡核苷酸

⏹一、核苷酸

⏹

（一）核酸中的糖

⏹D—核糖D—2脱氧核糖

⏹二者都是β型。

⏹差别：

2位羟基是否脱氧。

脱氧核糖与核糖

⏹

（二）碱基：

⏹1、嘌呤碱

⏹2、嘧啶碱

⏹3、稀有碱基

⏹稀有碱基大部分都是甲基化碱基

⏹tRNA稀有碱基约占10%

嘌呤碱基和嘧啶碱基

⏹（三）核苷：

戊糖与碱基通过糖苷键相连，C—N糖苷键。

⏹糖C1与嘧啶碱N1与嘌呤碱N9相连，碱基与糖环垂直。

⏹根据核苷中所含戊糖的不同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。

⏹命名先冠以碱基名称，糖环C加‘，碱基不加’。

⏹核苷的顺式结构和反式结构。

⏹ RNA某些修饰化和异构化的核苷，碱基、核糖均可被修饰，主要是甲基化。

⏹tRNA、rRNA还含有少量假尿嘧啶核苷。

核苷

⏹（四）核苷酸

⏹戊糖羟基的磷酸化成核苷酸。

⏹核糖核苷糖环上有3个自由羟基。

⏹脱氧核糖核苷糖环上有2个自由羟基。

⏹环化腺苷酸是细胞功能的调节分子和信号分子。

核苷酸

⏹二、核酸的共价结构

⏹

（一）核酸中核苷酸的连接方式

⏹RNA通过3‘，5‘–磷酸二酯键连接的核苷酸。

⏹DNA通过3‘，5‘–磷酸二酯键连接的核苷酸。

⏹表示方法：

书写顺序5‘——3’。

核苷酸的组成与连接

⏹1、线条式：

竖线碳链、碱基、磷酸

⏹2、文字式：

⏹5＇pＡpＣpＴpＴpＧpＡpＡpＣpＧ3＇DNA

5＇pＡpＣpＵpＵpＧpＡpＡpＣpＧ3＇RNA

⏹此式可进一步简化为：

⏹5＇ＡＣＴＴＧＡＡＣＧ3＇

5＇ＡＣＵＵＧＡＡＣＧ3＇

⏹

（二）DNA

⏹1、一级结构

⏹DNA的一级结构A、T、G、C通过3`，5`-磷酸二酯键连接，C’1—碱基，C’2——脱氧。

⏹碱基：

A、T、G、C

⏹脱氧核糖

⏹没有侧链

DNA的一级结构

⏹DNA的相对分子量非常大，通常一个染色体就是一个DNA分子，最大的染色体DNA可超过108bp.能编码的信息量十分巨大。

。

⏹细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因组成操纵子，有共同的调控序列，较少重复序列。

⏹真核生物的基因是断裂的，有内含子功能相关基因不组成操纵子，调控序列占比重大，有较大重复序列。

⏹越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。

⏹2、二级结构

⏹

（1）、模型建立的依据：

⏹aChargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析了各种生物的DNA的碱基组成。

结果显示：

⏹摩尔数：

A=T；G=C；A+C=G+T；A+G=C+T

⏹

（2）、DNA双螺旋的结构特征：

⏹A、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕，右手螺旋；

⏹B、骨架：

内侧——碱基垂直于纵轴；

⏹外侧——磷酸与戊糖、彼此通过3’、5’磷酸二酯键，糖环平面与纵轴平行。

⏹大沟宽1.2nm，深0.85nm；

⏹小沟宽0.6nm，深0.75nm；

⏹C、直径：

2nm，二相邻碱基高度0.34nm，二核苷酸夹角36度，旋转一周10个核苷酸，一周高度3.4nm；

⏹D、碱基互补配对：

A、T形成两个氢键；GC形成三个氢键，碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。

⏹（三）DNA二级结构的多态性

⏹DNA分子结构可受环境的影响而改变

⏹B型DNA：

在相对湿度92%下制得的纤维是B型结构，适中。

⏹A型DNA：

在相对湿度75%下制得的纤维是A型结构，宽短。

⏹Z型DNA：

碱基与中心的倾角9℃，细长。

⏹三股螺旋DNA.

⏹人工合成DNA发现，第三股嵌在大沟里。

⏹2、三级结构：

⏹细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中，双螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。

⏹超螺旋，三级结构中的一种。

⏹DNA压缩总原则：

多级螺旋，4级压缩。

⏹（三）RNA

⏹1、RNA结构的特点

⏹RNA与DNA结构十分相似，二者相比有几点不同：

⏹

（1），核糖：

⏹

（2），碱基：

A、G、C、U

⏹（3），二者在三维结构上的区别——RNA不具有规则的氢键结构，单链形式存在，只是回折，局部配对，不配对形成突环。

⏹2、tRNA

⏹•由70--90个核苷酸组成，在蛋白质合成过程中具有转运氨基酸、识别密码子的作用，在DNA反转录合成及基因表达调控中起着重要的作用。

⏹

（1）、结构特点：

⏹A、有较多的稀有碱基，多为转录后加工而来。

⏹B、3`末端为氨基酸接受臂CCA。

⏹C、5`末端作为GorC。

⏹2、二级结构—三叶草形：

⏹叶柄是双螺旋氨基酸臂；突环三大一小。

⏹A、接受臂：

接受活化AA，末端为CCA。

⏹B、TψC环：

ψ假鸟嘧啶，有TψC顺序。

⏹C、额外环：

变化最大区域，不同tRNA不同大小额外环。

⏹D、反密码环：

7个核苷酸组成，环中部反密码子。

三对碱基组成。

⏹E、二氢尿嘧啶环：

8---12核苷酸，两个二氢尿嘧啶。

⏹3、rRNA

⏹rRNA占RNA总量的80%以上，核糖体由大小两个亚基组成，大小亚基分别几种rRNA和数十种蛋白质组成。

⏹rRNA与几十种蛋白质组成的细胞颗粒——核糖体是细胞内合成蛋白质的工厂。

核糖体上催化肽键合成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA的构象，起辅助作用。

⏹4、mRNA

⏹

（1）原核生物mRNA结构特征

⏹原核生物的mRNA链上有多个编码区（多个基因），为多顺反子，5’和3‘端各有一段非翻译区。

⏹多顺反子：

一个转录本加工而成的mRNA序列中包含多个基团。

⏹编码区：

mRNA中以AUG为起点，以终止密码子为终点，编码AA的一系列密码子序列。

⏹

（2）真核生物mRNA结构特征

⏹真核生物的mRNA都是单顺反子。

⏹单顺反子：

一个转录本加工而成的mRNA序列只代表一个基因。

⏹mRNA5’端都有帽子结构。

⏹绝大多数真核生物mRNA具有poly（A）尾。

⏹帽子结构功能：

⏹a、增加mRNA稳定性，保护mRNA免遭5’外切酶的攻击。

⏹b、有助于核糖体对mRNA的识别和结合，使翻译得以正确起始。

⏹mRNApoly（A）尾功能：

⏹A、防止mRNA降解，大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。

⏹B、是mRNA穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。

⏹C、与翻译有关；切除poly（A）尾会影响翻译起始。

第三节核酸的性质及研究方法

⏹一、核酸的水解：

⏹

（一）酸水解：

⏹磷酸酯键与糖苷键对酸的敏感程度不同。

⏹磷酸酯键比糖苷键稳定；

⏹嘌呤的糖苷键比嘧啶糖苷键更不稳定；

⏹嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定。

⏹

（二）碱水解

⏹RNA的磷酸酯键易被碱水解；DNA的磷酸酯键对碱稳定。

⏹原因：

⏹1、RNA核糖上2‘-OH基，在碱性条件下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生2’，3‘环磷酸酯，进而分解成2’，3’核苷酸

⏹2、DNA核糖上无2‘-OH基，不能形成磷酸三酯中间物，因此可以抵抗碱水解。

⏹（三）酶水解：

⏹1、核糖核酸酶

⏹

（1）牛胰核糖核酸酶：

⏹专一性切割位点：

嘧啶核苷-3‘-磷酸与其它核苷酸之间的连键。

⏹产物：

3’-嘧啶核苷酸；或以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。

⏹水解机制：

同碱相似。

⏹

（2）核糖核酸酶T1

⏹专一性切割位点：

3‘-鸟苷酸与其相邻的5‘-核苷酸之间的连键。

⏹  产物：

3‘-鸟苷酸；或以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸。

⏹（3）核糖核酸酶T2

⏹  专一性切割位点：

3‘-腺苷酸与其相邻的5‘-核苷酸之间的连键。

⏹ 产物：

3‘-腺苷酸结尾的寡核苷酸。

⏹脱氧核糖核酸酶

⏹

（1）牛胰脱氧核糖核酸酶：

切断双链或单链DNA成为5‘-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度4个核苷酸。

⏹

（2）牛脾脱氧核糖核酸酶：

切断双链或单链DNA成为3‘-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度6个核苷酸。

⏹（3）链球菌脱氧核糖核酸酶：

产物为5‘-磷酸为末端的寡核苷酸，长短不一。

⏹（4）限制性内切酶：

在细菌中发现这类酶，主要降解外源DNA，对自身DNA无作用。

⏹特点：

切割位点往往是回文结构；具有高度专一性，识别双链特定的位点，将两条链切开成粘性，平头末端；用于染色体结构分析、基因测序的分析、基因的体外重组。

⏹二、核酸的酸碱性质

⏹1、碱基的解离

⏹嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮和取代基具有结合和释放质子的能力，因此是兼性离子；

⏹胞嘧啶的解离；

⏹胸腺嘧啶的解离；

⏹腺嘌呤的解离；

⏹鸟嘌呤和次黄嘌呤的解离；

⏹2、核苷的解离：

糖的存在增加了酸性解离

⏹3、核苷酸的解离：

⏹磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性。

⏹三、核酸的紫外吸收：

⏹碱基的共轭双键决定了核酸有紫外吸收。

⏹最大光吸收值260nm，是核酸定量以及定性的基础。

⏹用A260/A280的比值可以判断样品的纯度：

⏹纯DNA的A260/A280比值应大于1.8,

⏹纯RNA应达到2.0；

⏹摩尔吸光系数ε（P）值；ε（P）=A/CL。

⏹单核苷酸ε（P）值大于单链多核苷酸；

⏹单链核苷酸ε（P）值大于双链核苷酸，

⏹因此核酸变性时,ε（P）值增高，称增色效应；核酸复性时,ε（P）值降低，称减色效应。

⏹四、核酸的变性、复性及杂交

⏹

（一）变性：

⏹1、概念：

双螺旋氢键的断裂，不涉及共价键---磷酸二酯键断裂。

⏹2、引起变性的因素：

⏹1）温度的升高；

⏹2）碱酸度改变；

⏹3）尿素、甲醛等。

⏹3、变性的特点：

⏹1）结构变成无规则线团；

⏹2）260nm紫外吸光度升高，粘度下降；

⏹3）爆发式，变性发生在很窄的温度范围，有一个相变的过程。

⏹熔解温度（Tm值）：

双螺旋失去一半时的温度。

⏹4、影响DNATm的因素：

⏹

（1）DNA均一性：

⏹均质DNA熔解过程在一个较窄的温度范围内；异质DNA熔解过程在一个较宽的温度范围内。

⏹

（2）G-C含量：

⏹G-C含量越高Tm值愈高；

⏹原因：

GCA=T

⏹测定Tm可以推算出DNA碱基的百分组成。

⏹经验公式：

XG-C=（Tm-69.3）X2.44；

⏹（3）介质离子强度

⏹离子强度较低的介质中,Tm值较低,熔解温度范围较宽；

⏹离子强度较高的介质中,Tm值较高,熔解温度范围较窄。

⏹RNA的变性：

⏹螺旋区较少,变性Tm值较低；tRNA螺旋区较多,变性Tm值较高，类似于DNA。

⏹

（二）复性

⏹两条分开的链重新闭合为双螺旋称复性，复性可部分恢复理化性质，变性DNA骤然降温不能复性，据此可制备单链核酸探针。

⏹缓慢冷却复性称退火。

片段越大复性越慢；浓度越大复性越快。

双螺旋呼吸：

双链DNA配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，特别是在稳定性较低的富含A-T的区段。

在微观上，常常出现瞬间的单链泡状结构，这种现象称为双螺旋的呼吸作用。

一些蛋白质可识别这种结构，并在单链结构下阅读和识别DNA内部所含信息。

⏹（三）核酸的杂交：

⏹1、概念：

不同来源的分子，经热变性后冷却复性，如异源间某些区域有相同的序列，则会形成杂交分子。

（四）、DNA聚合酶链反应（PCR）

•原理：

•1、变性：

通过加热使双链DNA变成单链DNA。

•2、退火：

温度突然降低，引物与模板链局部形成杂交链。

•3、延伸：

在DNA聚合酶的作用下，进行DNA链延伸反应。

•以上三步为一个循环。

基本步骤：

•1、设计一对引物：

应尽量减少非特异产物。

•2、优化反应体系：

适量模板，引物，4种dNTP,TaqDNA聚合酶,Mg+。

•3、选择热循环温度：

变性温度，退火温度，延伸温度。

•4、鉴定扩增产物：

一般用凝胶电泳。

⏹2、Southern杂交：

固相杂交

⏹样品酶解

⏹五、核酸含量的测定：

⏹1、定磷法：

样品灰化：

浓硫酸或过氯酸处理生成无机磷＋钼酸胺磷钼酸+还原剂钼蓝。

⏹2、定糖法：

RNA戊糖糠醛＋苔黑酚＋三氯化铁绿色

⏹DNA脱氧戊糖羟基酮醛+二苯胺蓝色

⏹3、紫外吸收法：

测碱基

⏹六、核酸的凝胶电泳

⏹用与核酸的分离、鉴定。

⏹核酸带负电荷正极，超螺旋最快，线形次之，开环最慢。

⏹1、琼脂糖凝胶电泳：

核酸大片段，

⏹2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：

核酸小片段。

⏹溴化乙锭（EB），紫外光下萤光显色。

⏹思考题：

⏹1、简述tRNA、rRNA、mRNA在蛋白质合成中的作用。

⏹2、试比较DNA和RNA在结构和功能上的区别。