第四章核酸.docx

1、第四章核酸第四章 核酸第一节 概论 一、核酸的发现和研究简史 （一）核酸的发现 1868年瑞士青年科学家Miescher在外科绷带脓细胞分离得到细胞核，从中提取出一种含磷量很高的酸性化合物称为核素。 1889年Altmann发明了从酵母和动物组织中制备不含蛋白质的核酸的方法。首次提出了核酸的名称。 1894年Hammars证明了酵母核酸中的糖是戊糖。 1909年Levene年确定戊糖是2-脱氧-D-核糖。 19世纪末20世纪初Kossel鉴定了碱基。 （二）核酸的早期研究 Levene“四核苷酸假说”阻碍了核酸的研究。 20世纪40年代，显微紫外分光光度法、组织化学法、亚细胞单位的分离与化学分

2、析法的应用，推翻了“四核苷酸假说”。 （三）DNA双螺旋结构模型结构的建立 早期分子生物学的三个学派： 结构学派：Astbury用X-射线结晶学技术研究生物大分子的三维结构，并认为研究其起源和功能是分子生物学的主要任务。 信息学派：Delbruck, Schrodinger、S.Luria 认为 生命的本质是信息传递的问题：信息如何被编码？如何保持其稳定性？偶然的变异是如何产生的？ 生化遗传学派：用生物化学的方法阐明基因是如何行使功能而控制特定性状的。 1953 Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型。说明了基因的结构、信息和功能三者的关系，使三个学派得到统一，并推动了分子生物学的发

3、展。 1956年Kornberg发现DNA聚合酶。DNA双螺旋立体结构 1961年Jacob Monod提出操纵子学说，并假设了RNA的功能。 1965年Holley测定了酵母丙氨酸RNA的核苷酸序列。 1966年Nirenberg破译了遗传密码。 1970年发现了逆转录酶。 （四）生物技术的兴起 七十年代前期DNA重组技术的建立的基础： DNA的切割技术工具酶的发现和应用。 分子克隆DNA体外重组体的无性繁殖。 1975,1976 快速测序酶法与化学法测序技术的建立。 基因重组技术可应用于改变生物机体的性状特征、改造基因、以至改造物种。导致了新的生物技术产业群的兴起。 1981年Cech发现

4、了核酶催化功能。 1983年Simons,Mizuno 反义RNA调节功能。 （五）人类基因组计划开辟了生命科学的新纪元 1990年人类基因组计划实施庞大的人类基因组计划，在经过各国科学家的多年努力，已取得巨大的成就。十多种低等模式生物的基因组序列测定已完成； 第一个多细胞生物线虫基因组的DNA全序列测定也在1998年底完成； 人类基因组的全序列提前到2003、4、14完成。 生命科学已进入了后基因组时代，研究重心已从基因测序转移到基因的功能。 功能基因组学 蛋白质组学 结构基因组学 RNA组学 二、 核酸的种类和分布 （一）、类别：核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）。 核糖核

5、酸（RNA）分成三类： 1、信使RNA（mRNA）：单链差别较大，其顺序决定蛋白质的氨基酸顺序。 2、转移RNA（tRNA）：携带氨基酸，核糖体上，每种氨基酸至少有一种tRNA。 3、核糖体RNA（rRNA）：不稳定，与核蛋白结合。 二、分布： 1、DNA： 原核生物集中于核区. 真核生物细胞核,线粒体、叶绿体亦含有DNA. 原核、真核生物的质粒 病毒含有DNA或RNA. 2、RNA 存在于细胞质和细胞核中。 发现了许多新的具有特殊功能的RNA： 如反义RNA，核酶等. 病毒和亚病毒RNA有许多种：正链RNA病毒、负链RNA病毒、类病毒、卫星病毒等 . 三、核酸的生物功能 （一）DNA是主要的

6、遗传物质 1、细菌转化实验 2、噬菌体侵染实验 证明了DNA是主要遗传物质 3、有些病毒的遗传物质是RNA. （二）RNA参与蛋白质的生物合成 rRNA占细胞总RNA的80%，它是装配者并起催化作用. t RNA占细胞总RNA的15%，它是转换器，携带氨基酸并起解译作用. mRNA占细胞总RNA的35%，它是信使，携带DNA的遗传信息,并起蛋白质合成的模板作用. （三）RNA功能的多样性 1、控制蛋白质合成. 2、作用于RNA转录后加工与修饰. 3、基因表达与细胞功能的调节. 4、生物催化与其他细胞持家功能. 5、遗传信息的加工与进化.第二节 核酸的结构 核酸 全部磷酸二酯键断裂 核苷酸 核苷

7、酸 磷酸单酯键断裂 核苷+磷酸 核苷 糖苷键断裂 碱基+核糖 核酸 部分磷酸二酯键断裂 寡核苷酸 一、核苷酸 （一）核酸中的糖 D核糖 D2脱氧核糖 二者都是 型。 差别：2 位羟基是否脱氧。脱氧核糖与核糖 （二）碱基： 1、嘌呤碱 2、嘧啶碱 3、稀有碱基 稀有碱基大部分都是甲基化碱基 tRNA稀有碱基约占10%嘌呤碱基和嘧啶碱基 （三）核苷：戊糖与碱基通过糖苷键相连，CN糖苷键。 糖C1与嘧啶碱N1与嘌呤碱N9相连，碱基与糖环垂直。 根据核苷中所含戊糖的不同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。 命名先冠以碱基名称，糖环C加，碱基不加 。 核苷的顺式结构和反式结构。 RNA某些修饰化和异构化的核苷

8、 ，碱基、核糖均可被修饰，主要是甲基化。 tRNA 、 rRNA还含有少量假尿嘧啶核苷。核苷 （四）核苷酸 戊糖羟基的磷酸化成核苷酸。 核糖核苷糖环上有3个自由羟基。 脱氧核糖核苷糖环上有2个自由羟基。 环化腺苷酸是细胞功能的调节分子和信号分子。核苷酸 二、核酸的共价结构 （一）核酸中核苷酸的连接方式 RNA通过3，5 磷酸二酯键连接的核苷酸。 DNA通过3， 5磷酸二酯键连接的核苷酸。 表示方法：书写顺序53。核苷酸的组成与连接 1、线条式：竖线碳链、碱基、磷酸 2、文字式： 5ppppppppp3DNA5ppppppppp3RNA 此式可进一步简化为： 5353 (二）DNA 1、一级结构

9、 DNA的一级结构A、T、G、C通过3，5-磷酸二酯键连接，C1碱基，C2脱氧。 碱基：A、T、G、C 脱氧核糖 没有侧链DNA的一级结构 DNA的相对分子量非常大，通常一个染色体就是一个DNA 分子，最大的染色体DNA可超过 108 bp .能编码的信息量十分巨大。 细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因组成操纵子，有共同的调控序列，较少重复序列。 真核生物的基因是断裂的，有内含子功能相关基因不组成操纵子，调控序列占比重大，有较大重复序列。 越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。 2、二级结构 （1）、模型建立的依据： a Chargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析

10、了各种生物的DNA的碱基组成。结果显示： 摩尔数：A=T；G=C；A+C=G+T； A+G=C+T （2）、DNA双螺旋的结构特征： A、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕，右手螺旋； B、骨架：内侧碱基垂直于纵轴； 外侧磷酸与戊糖、彼此通过3、5磷酸二酯键，糖环平面与纵轴平行。 大沟宽1.2nm，深0.85nm； 小沟宽0.6nm，深0.75nm； C、直径：2nm，二相邻碱基高度0.34nm，二核苷酸夹角36度，旋转一周10个核苷酸，一周高度3.4nm； D、碱基互补配对：A、T形成两个氢键；G C形成三个氢键，碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。 （三）DNA二级结构的多态性 DNA分子

11、结构可受环境的影响而改变 B型DNA：在相对湿度92% 下制得的纤维是B型结构，适中。 A型DNA：在相对湿度75%下制得的纤维是A型结构，宽短。 Z型DNA：碱基与中心的倾角9，细长。 三股螺旋DNA. 人工合成DNA发现，第三股嵌在大沟里。 2、三级结构： 细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中，双螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。 超螺旋，三级结构中的一种。 DNA压缩总原则：多级螺旋，4级压缩。 （三）RNA 1、RNA结构的特点 RNA与DNA结构十分相似，二者相比有几点不同： （1），核糖： （2），碱基：A、 G、 C、 U （3），二者在三维结构上的区别RNA不具有规则的氢键

12、结构，单链形式存在，只是回折，局部配对，不配对形成突环。 2、 tRNA 由70-90个核苷酸组成，在蛋白质合成过程中具有转运氨基酸、识别密码子的作用，在DNA反转录合成及基因表达调控中起着重要的作用。 （1）、结构特点： A、有较多的稀有碱基，多为转录后加工而来。 B、3末端为氨基酸接受臂CCA。 C、5末端作为G or C。 2、二级结构三叶草形： 叶柄是双螺旋氨基酸臂；突环三大一小。 A、接受臂：接受活化AA，末端为CCA。 B、TC环：假鸟嘧啶，有TC顺序。 C、额外环：变化最大区域，不同tRNA不同大小额外环。 D、反密码环：7个核苷酸组成，环中部反密码子。三对碱基组成。 E、二氢尿

13、嘧啶环：8-12核苷酸，两个二氢尿嘧啶。 3、rRNA rRNA占RNA总量的80%以上，核糖体由大小两个亚基组成，大小亚基分别几种rRNA和数十种蛋白质组成。 rRNA与几十种蛋白质组成的细胞颗粒核糖体是细胞内合成蛋白质的工厂。核糖体上催化肽键合成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA的构象，起辅助作用。 4、mRNA （1）原核生物mRNA结构特征 原核生物的mRNA链上有多个编码区（多个基因），为多顺反子，5和3端各有一段非翻译区。 多顺反子：一个转录本加工而成的mRNA序列中包含多个基团。 编码区：mRNA中以AUG为起点，以终止密码子为终点，编码AA的一系列密码子序列。 （2）真核生物

14、mRNA结构特征 真核生物的mRNA都是单顺反子。 单顺反子：一个转录本加工而成的mRNA序列只代表一个基因。 mRNA5端都有帽子结构。 绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾。 帽子结构功能： a、增加mRNA稳定性，保护mRNA免遭5外切酶的攻击。 b、有助于核糖体对mRNA的识别和结合，使翻译得以正确起始。 mRNA poly(A)尾功能： A、防止mRNA降解，大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。 B、是mRNA穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。 C、与翻译有关；切除poly(A)尾会影响翻译起始。第三节 核酸的性质及研究方法 一、核酸的水解： （一）酸水解： 磷酸酯键与

15、糖苷键对酸的敏感程度不同。 磷酸酯键比糖苷键稳定； 嘌呤的糖苷键比嘧啶糖苷键更不稳定； 嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定 。 （二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱水解；DNA的磷酸酯键对碱稳定。 原因： 1、RNA核糖上2-OH基，在碱性条件下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生2，3环磷酸酯，进而分解成2，3核苷酸 2、DNA核糖上无2-OH基，不能形成磷酸三酯中间物，因此可以抵抗碱水解。 （三）酶水解： 1、核糖核酸酶 （1）牛胰核糖核酸酶： 专一性切割位点：嘧啶核苷-3-磷酸与其它核苷酸之间的连键。 产物：3-嘧啶核苷酸；或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。 水解机制：同碱相似。

16、（2）核糖核酸酶T1 专一性切割位点：3-鸟苷酸与其相邻的5-核苷酸之间的连键。 产物： 3-鸟苷酸；或以3 -鸟苷酸结尾的寡核苷酸。 （3）核糖核酸酶T2 专一性切割位点：3-腺苷酸与其相邻的5-核苷酸之间的连键。 产物： 3 -腺苷酸结尾的寡核苷酸。 脱氧核糖核酸酶 （1）牛胰脱氧核糖核酸酶：切断双链或单链DNA成为5-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度4个核苷酸。 （2）牛脾脱氧核糖核酸酶：切断双链或单链DNA成为3-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度6个核苷酸。 （3）链球菌脱氧核糖核酸酶：产物为5-磷酸为末端的寡核苷酸，长短不一。 （4）限制性内切酶：在细菌中发现这类酶，主要降解外源DNA，

17、对自身DNA无作用。 特点：切割位点往往是回文结构；具有高度专一性，识别双链特定的位点，将两条链切开成粘性，平头末端；用于染色体结构分析、基因测序的分析、基因的体外重组。 二、核酸的酸碱性质 1、碱基的解离 嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮和取代基具有结合和释放质子的能力，因此是兼性离子； 胞嘧啶的解离； 胸腺嘧啶的解离； 腺嘌呤的解离； 鸟嘌呤和次黄嘌呤的解离； 2、核苷的解离：糖的存在增加了酸性解离 3、核苷酸的解离： 磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性。 三、核酸的紫外吸收： 碱基的共轭双键决定了核酸有紫外吸收。 最大光吸收值260nm，是核酸定量以及定性的基础。 用A260/A280的比值

18、可以判断样品的纯度： 纯DNA的A260/A280比值应大于1.8, 纯RNA应达到2.0； 摩尔吸光系数(P)值；(P)=A/CL。 单核苷酸(P) 值大于单链多核苷酸； 单链核苷酸(P)值大于双链核苷酸， 因此核酸变性时, (P)值增高，称增色效应；核酸复性时, (P)值降低，称减色效应。 四、核酸的变性、复性及杂交 （一）变性： 1、概念：双螺旋氢键的断裂，不涉及共价键-磷酸二酯键断裂。 2、引起变性的因素： 1）温度的升高； 2）碱酸度改变； 3）尿素、甲醛等。 3、变性的特点： 1）结构变成无规则线团； 2）260nm紫外吸光度升高，粘度下降； 3）爆发式，变性发生在很窄的温度范围，

19、有一个相变的过程。 熔解温度（Tm值）：双螺旋失去一半时的温度。 4、影响DNA Tm的因素： （1）DNA均一性： 均质DNA熔解过程在一个较窄的温度范围内；异质DNA熔解过程在一个较宽的温度范围内。 （2）G-C含量： G-C含量越高Tm值愈高； 原因：G C A=T 测定Tm可以推算出DNA碱基的百分组成。 经验公式：XG-C=（ Tm-69.3)X2.44； （3）介质离子强度 离子强度较低的介质中,Tm值较低, 熔解温度范围较宽； 离子强度较高的介质中,Tm值较高,熔解温度范围较窄。 RNA的变性： 螺旋区较少,变性Tm值较低；tRNA螺旋区较多,变性Tm值较高，类似于DNA。 （二

20、）复性 两条分开的链重新闭合为双螺旋称复性，复性可部分恢复理化性质，变性DNA骤然降温不能复性，据此可制备单链核酸探针。 缓慢冷却复性称退火。片段越大复性越慢；浓度越大复性越快。双螺旋呼吸：双链DNA配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，特别是在稳定性较低的富含A-T的区段。在微观上，常常出现瞬间的单链泡状结构，这种现象称为双螺旋的呼吸作用。一些蛋白质可识别这种结构，并在单链结构下阅读和识别DNA内部所含信息。 （三）核酸的杂交： 1、概念：不同来源的分子，经热变性后冷却复性，如异源间某些区域有相同的序列，则会形成杂交分子。（四）、DNA聚合酶链反应（PCR）原理：1、变性：通过加热使双链D

21、NA变成单链DNA。2、退火：温度突然降低，引物与模板链局部形成杂交链。3、延伸：在DNA聚合酶的作用下，进行DNA链延伸反应。以上三步为一个循环。基本步骤：1、设计一对引物：应尽量减少非特异产物。2、优化反应体系：适量模板，引物，4种dNTP,TaqDNA聚合酶,Mg+。3、选择热循环温度：变性温度，退火温度，延伸温度。4、鉴定扩增产物：一般用凝胶电泳。 2、Southern杂交：固相杂交 样品酶解 五、核酸含量的测定： 1、定磷法：样品灰化：浓硫酸或过氯酸处理生成无机磷钼酸胺 磷钼酸+还原剂 钼蓝。 2、定糖法：RNA戊糖 糠醛苔黑酚三氯化铁 绿色 DNA脱氧戊糖 羟基酮醛+二苯胺 蓝色 3、紫外吸收法：测碱基 六、核酸的凝胶电泳 用与核酸的分离、鉴定。 核酸带负电荷 正极，超螺旋最快，线形次之，开环最慢。 1、琼脂糖凝胶电泳：核酸大片段， 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：核酸小片段。 溴化乙锭（EB），紫外光下萤光显色。 思考题： 1、简述tRNA 、 rRNA 、 mRNA 在蛋白质合成中的作用。 2、试比较DNA和RNA在结构和功能上的区别。