植物基因组DNA地提取及其定性定量分析报告.docx
《植物基因组DNA地提取及其定性定量分析报告.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《植物基因组DNA地提取及其定性定量分析报告.docx(10页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
植物基因组DNA地提取及其定性定量分析报告
《分子生物学》实验报告
实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析
【实验目的】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。
【实验原理】
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度下(大于0.7MNaCl),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。
利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。
然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来,再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,最后经乙醇沉淀得到DNA。
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。
把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此,在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离。
凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快,其次为线状DNA(LDNA),最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。
核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键,在260nm波长处有特异的紫外吸收峰,其吸收强度与核酸的浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。
1OD260相当于dsDNA50μg/mL,ssDNA33μg/mL和ssRNA40μg/mL。
可以此来计算核酸样品的浓度。
紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度,若DNA的A260/A280比值高于2.0,则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。
【仪器、材料与试剂】
一、仪器及耗材
离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000μL量程各一支)、100mL或250mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5mLEP管、PE手套和乳胶手套。
二、药品
三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。
三、试剂
1.2×CTABbuffer【1】
2.70%乙醇【2】
3.RNaseA(天根)【3】
4.0.5×TBE缓冲液(工作浓度)【4】
5.6×loadingbuffer【5】
6.核酸染料(赛百盛)
7.DNAmarkerDL2000(Takara)
8.酚/氯仿(1:
1,V/V)【6】
【实验步骤】
1.取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mLEP管,在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。
2.加入0.6mL2×CTAB提取液(用前加入0.2﹪的巯基乙醇),混匀,65℃水浴30min,每10min颠倒混匀一次。
3.取出离心管,冷却后加入0.6mL酚氯仿混合液,混匀。
4.11,500rpm室温离心8min(若没离好可重复一次)。
5.将上清液(约400μL)转移到另一新的1.5mL离心管中。
6.加入与上清等体积的氯仿,混匀,11,500rpm离心8min,取上清(约350μL)。
7.加入600μL无水乙醇,上下颠倒混匀,-80℃放置30min。
8.4℃,15,800rpm离心20min,弃上清。
9.1mL70%乙醇(预冷)洗涤沉淀2次,上下颠倒几次,不能vortex,7,000g离心3min,弃上清,风干。
10.加入30μL无菌水(含20μg/mLRNaseA),37℃溶解DNA30min。
11.取5μLDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测:
(1)制备琼脂糖凝胶
称取0.3g琼脂糖,放入三角瓶中,加入30mL0.5×TBE缓冲液,置微波炉中加热至完全熔化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液。
(2)胶板的制备
①取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙),形成一个模具。
②将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并在固定位置放好样品梳子。
③待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时,加入核酸染料1.5μL,摇匀,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
④室温下静置直至凝胶完全凝固(室温下30-45min),垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中。
⑤加入0.5×TBE电泳缓冲液至电泳槽中,使缓冲液没过胶面约1mm。
(3)加样
在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×。
用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,将DNAmarker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。
每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面(注意:
加样前要先记下加样的顺序)。
(4)电泳
①接通电泳槽与电泳仪的电源,DNA片段从负极(黑色插头)向正极(红色插头)移动)。
DNA的迁移速度与电压成正比,但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低,因此,最高电压不超过5V/cm。
②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳。
③紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带(戴手套操作),采用凝胶成像系统拍照保存。
12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度:
(1)用0.1×TE对待测DNA样品按1:
20或合适的倍数稀释。
(2)开机,仪器会自动对光路及分析软件进行检测,待显示屏上出现“instrumentReady”时,进入核酸测定窗口。
(3)调零。
先用0.1×TE缓冲液注入样品杯,放入样品槽,关闭盖板。
点击“setref”键,仪器自动校正零点。
将样品槽内的样品杯取出,换上待测样品。
(4)吸70μL已稀释的DNA样品转入石英样品杯,放入样品槽,关闭盖板。
如果样品很少,可以用5-7μL的石英样品杯。
点击“enter”键,仪器即进入分析状态。
窗口同时显示260nm和280nm处的光密度(OD值)及A260/A280nm和A280/A260nm的比率以及DNA样品的浓度等。
(5)打开盖板,取出石英样品杯,吸出样液,用超纯水清洁石英样品杯,风干后,再加入下一个待测样品。
(6)DNA纯度:
以A260/A280比值来反映。
当A260/A280比值<1.8时,说明样品存在蛋白质或酚等杂质,可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除残留酚,再用无水乙醇沉淀,TE溶解后再测定。
当A260/A280比值>2.0,说明样品存在RNA污染,可以用RNA酶处理样品去除RNA。
实验结果与分析
1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组DNA
C组电泳结果如图所示
1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA5μl样品,电泳结果如图所示
有DNA条带出现,表明已经成功提取到了拟南芥的基因组DNA。
2.DNA样品的OD检测
检测OD值
C1:
浓度:
1061.7ng/
OD260/OD280:
1.87
表明:
C1接种DNA质量良好。
(如下图所示)
C2:
浓度:
1017.6ng/
OD260/OD280:
1.86
表明:
C2接种DNA质量良好。
(如下图所示)
C3:
浓度:
711.0ng/
OD260/OD280:
1.86
表明:
C3接种DNA质量良好。
(如下图所示)
注意事项:
1、磨样时要反复插入液氮中冷冻,但要避免液氮进入管中;
2、取酚氯仿混合液时要吸取下层;
3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀;
4、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层;
5、晾干沉淀时,要尽可能的吸除酒精。
实验二PCR扩增目的片段
【实验目的】
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
【实验原理】
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是一种体外核酸扩增系统,其原理类似DNA分子的天然复制过程,是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:
DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的DNA引物、耐热DNA聚合酶。
PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。
整个扩增过程分三步:
①变性,加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段;②退火,快速降低温度至50-60℃后,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段;③延伸,溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5′→3′方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。
完成以上三步为一个循环,每经过一个循环,样本中的DNA量就增加一倍,新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。
经过25-30个循环后,DNA可扩增106-109倍。
PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。
【仪器、材料与试剂】
一、仪器及耗材
PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器(0.1-2.5μL)、200μLPCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器(10、100、1000μL量程各一支)、100mL或250mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。
二、试剂
1.10×缓冲液
2.DNA模板1ng/μL(以实验一提取的拟南芥基因组DNA为模板)
3.dNTPMix(Takara)
4.引物
P3:
5′-CGGGTACCGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGG-3′
P5:
5′-ACTCTAGATGAGTAAAACAGAGGAGGGTCTCAC-3′
引物溶液浓度:
2μM
5.rTaq酶5U/μL
6.低熔点琼脂糖
7.去离子水或TE(pH7.6)【7】
【实验步骤】
1.在200μLPCR管内配制20μL反应体系:
反应物体积/μL
ddH2O11.3
10×PCR缓冲液2.0
dNTP1.6(终浓度20—200μM)
引物12.0(引物终浓度0.2μM)
引物22.0(引物终浓度0.2μM)
模板DNA1.0
rTag酶0.1
Total20
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。
加样后用手轻弹混匀,6,000rpm离心15sec使反
应成分集于管底。
3.PCR反应热循环程序设置:
①94℃预变性3min;
②94℃变性30sec;
③64℃退火30sec;30cycles
④72℃延伸1min;
⑤72℃延伸10min;
⑥16℃pause
反应结束后短暂离心,置4℃保存备用。
4.配制1%的琼脂糖凝胶。
5.取5μLPCR产物,加1μL的6×loadingbuffer(上样缓冲液),轻弹混匀后进行电泳检测。
6.如果PCR产物非常特异,可以直接用于与载体的重组连接。
【实验结果】
本实验扩增片段长652bp。
注意事项:
1、加样时要精确用移液器。
2、检查PCR仪是否热盖。
3、每种试剂弹化后要离心;
做MIX时,最后加酶,分装之前要混匀;
分装后需离心混匀。
实验二的PCR扩增
实验结果与分析
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,电泳结果如图所示,有DNA条带,约600bp;或者无DNA条带。