相同基因型大白菜基于不同倍性水平的生物学性状及基因表达研究.docx
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相同基因型大白菜基于不同倍性水平的生物学性状及基因表达研究
目录
1引言1
1.1多倍体的产生与鉴定1
1.1.1多倍体的产生途径1
1.1.2多倍体的鉴定3
1.2不同倍性植株特征特性研究4
1.3不同倍性作物基因表达水平研究4
2相同基因型不同倍性大白菜的获得与鉴定6
2.1试验材料6
2.2研究内容与试验方法6
2.2.1相同基因型不同倍性大白菜的获得6
2.2.2相同基因型不同倍性大白菜的鉴定7
2.2.3相同基因型不同倍性大白菜性状的调查7
2.3结果与分析7
2.3.1二倍体、四倍体大白菜的获得7
2.3.2相同基因型大白菜二倍体、四倍体杂交8
2.3.3倍性鉴定9
2.3.4相同基因型不同倍性植株特征特性的调查11
3相同基因型不同倍性大白菜ARGOS基因表达差异的研究14
3.1试验材料14
3.2研究内容与试验方法14
3.2.1取材14
3.2.2试剂及主要仪器14
3.2.3试验方法14
3.3结果与分析17
3.3.1所提总RNA检测结果17
3.3.2引物17
3.3.3叶片ARGOS基因表达差异分析17
3.3.4花蕾ARGOS基因表达差异分析19
4相同基因型不同倍性大白菜ASY1基因表达差异的研究22
4.1试验材料22
4.2研究内容与试验方法22
4.2.1材料处理22
4.2.2试剂及主要仪器22
4.2.3试验方法22
4.3结果与分析23
4.3.1所取花蕾大小及相对应时期23
4.3.2引物23
4.3.3叶片ASY1基因表达差异分析24
4.3.4花蕾ASY1基因表达差异分析24
5讨论29
5.1秋水仙素诱导分析29
5.2二倍体与四倍体杂交获得非整倍体29
5.3大白菜ARGOS基因表达量分析29
5.4ASY1基因表达量分析30
6结论31
参考文献32
在读期间发表的学术论文36
作者简历37
致谢38
摘要
以本实验室特有的大白菜“85-1”单倍体为试材，通过秋水仙素对其进行诱导，经细胞学鉴定、DNA流式细胞仪鉴定获得了相同基因型二倍体、四倍体大白菜植株。
对相同基因型大白菜单倍体、二倍体、四倍体进行了植株特征特性调查、细胞形态学观测等，比较了相同基因型不同倍性大白菜在生物学特性方面的差异；同时利用实时荧光PCR技术开展了对控制大白菜器官大小的ARGOS基因、与同源染色体联会相关的ASY1基因在单倍体、二倍体、非整倍体和四倍体植株间基因表达水平的研究，进而分析了不同倍性大白菜特性与相关基因表达的关系。
主要研究结果如下：
1.浓度0.2%秋水仙素处理大白菜单倍体组培苗48h得到二倍体的诱导率为13.72%，且处理后植株长势良好。
选用此处理浓度和时间对单倍体大白菜“85-1”进行诱导，获得了相同基因型的单倍体、二倍体、四倍体植株。
2.以来自于同一单倍体的二倍体大白菜为母本与四倍体大白菜杂交，取授粉后8d的子房在改良White中进行离体培养获得了成活胚珠。
将成活的胚珠接于1/2MS培养基上培养，30d后得到再生植株，根尖染色体计数结果表明，获得的植株为非整倍体大白菜（2n=24）。
3.相同基因型的单倍体、二倍体、非整倍体和四倍体大白菜在植株性状、细胞学形态方面均表现出差异。
随着染色体数目的增加，单倍体、二倍体、非整倍体、四倍体叶片呈增加的趋势。
与单倍体植株花器官相比，二倍体、四倍体以及非整倍体植株花蕾和花瓣明显增大，花瓣形状为倒卵形；单倍体花药较小、有少量或无花粉，二倍体、四倍体花药正常、且均有花粉。
4.利用实时荧光PCR对相同基因型的单倍体、二倍体、非整倍体和四倍体大白菜叶片、花蕾中的的ARGOS基因进行基因表达差异的研究，结果表明：
在叶片和花蕾中ARGOS基因的表达量，均随着倍性的增加呈非线性增加的趋势，与不同倍性大白菜叶片、花器官大小变化趋势一致。
相对于二倍体大白菜叶片ARGOS基因表达而言，单倍体叶片ARGOS基因表达量最低，仅为二倍体表达量的0.451倍；四倍体叶片ARGOS基因表达量最高，为二倍体表达量的2.144倍；而非整倍体（2n=24）的表达量是二倍体的1.580倍。
相对于二倍体大白菜花蕾ARGOS基因表达而言，单倍体花蕾ARGOS基因表达量仅为二倍体表达量的0.233；四倍体花蕾ARGOS基因表达量最高，为二倍体表达量的2.457倍；而非整倍体（2n=24）的表达量高于二倍体，为二倍体的1.812倍。
5.利用实时荧光PCR对相同基因型的单倍体、二倍体、非整倍体和四倍体大白菜的ASY1基因进行基因表达差异的研究，结果表明：
ASY1基因在大白菜叶片中不表达；同一时期，不同倍性大白菜花蕾中，二倍体ASY1基因的表达量最高，四倍体次之，单倍体和非整倍体较低。
同一材料，花蕾减数分裂期前和成熟花粉粒期，ASY1基因表达量较减数分裂期明显下降，且减数分裂期前和成熟花粉粒期ASY1基因的表达量接近。
关键词：
相同基因型；不同倍性；大白菜；生物学性状；基因表达
ResearchonthebiologicalcharacterandgeneexpressionofdifferentploidyChinesecabbagewiththesamegenotype
Author：
HuaFan
Major：
Olericulture
Tutor：
ShenShu-xing
GuAi-xia
（CollegeofHorticulture,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,China071001）
Abstract
OnegenotypeofhaploidChinesecabbage“85-1”wasinducedbycolchicinetoproducediploidandtetraploidplants.Theploidylevelsofaboveplantswereidentifiedbycytologicalcharactersandflowcytometry.Weinvestgatedtheplantcharacteristicsandcellmorphologies,andcomparedthedifferencesinbiologicalcharacteristicsofhaploid,diploidandtetraploidplantsderivedfromasamegenotype.Thereal-timefluorescentPCRtechnologywasusedtostudytheexpressionlevelsofARGOSgenerelatedtothesizeofChinesecabbageorganandASY1generelatedtotheconfederationofhomologouschromosomes.Themainresultsarelistedasfollows:
1.ThesamegenotypeofhaploidandtetraploidcabbageswereobtainedThehaploidseedlingsofChinesecabbageweretreatedby0.2%concentrationofcolchicinewith48hours,resultinginhealthydiploidplantswithinducementratioof13.72%.Usingabovetreatment,thehaploid,diploidandtetraploidChinesecabbagesderivedfromasamegenotypewereobtained.
2.ByembryorescuetechniquesinimprovedWhiteculturemedium,thesurvivedovulesweregotfromovariesafter8dayspollinationthatwerederivedfromcrossingbetweendiploidasmaleandtetraploidasfemale.After30daysculturein1/2MSmediumforthesurvivedovaries,theproducedregenerationplantswereidentifiedasaneuploidyChinesecabbage（2n=24）bycountingchromosomesofroottip.
3.ThereweredifferencesinplanttraitandcytologymorphologyamongdifferentploidyplantswiththesamegenotypeofChinesecabbage.Withtheincreaseofchromosomenumber,theleafynumberofhaploid,diploid,aneuploidy,tetraploidwasincreased.Comparedwiththeflowerorganofhaploidplants,budsandflowerpetalsofdiploid,tetraploidandaneuploidplantswereincreasedclearlyinsizeandthepetalsshapewasobovate.Theantherofhaploidwassmallwithlittleorwithoutpollens,whileanthersofdiploidandtetraploidwerenormalwithpollens.
4.ThegeneARGOSexpressioninleafandflowerbudofhaploid,diploid,aneuploidandtetraploidwiththesamegenotypewasdetectedbythereal-timePCR.Theresultsshowedthatwiththeincreaseofploidylevel,thegeneARGOSexpressionwasincreasedinnonlinear,withthesametrendasvariationinleafandflowerorgansize.ThegeneARGOSexpressioninleafofhaploidwaslowestamongdifferentploidyplants,withonly0.451timesofexpressionquantityindiploid;theexpressionquantityintetraploidplantwasthehighest,with2.144timesofindiploid;whiletheexpressioninaneuploid（2n=24）was1.580timesofindiploid.Inflowerbud,thegeneARGOSexpressionlevelinhaploidwas0.233timesofindiploid;theexpressionquantityintetraploidplantwasthehighest,with2.457timesofindiploid;whiletheexpressioninaneuploid（2n=24）washigherthanindiploid,with1.812timesofindiploid.
5.ThegeneASY1expressioninleafandflowerbudofhaploid,diploid,aneuploidandtetraploidwiththesamegenotypewasdetectedbythereal-timePCR.TheresultsshowedthatthegeneASY1wasnotexpressedinChinesecabbageleaf;atthesameperiod,itsexpressionindiploidwasthehighest,itsexpressioninhaploidandaneuploidwerelowest;forasamegenotype,theexpressionbeforemeiosisandinmaturepollenwassimilarandwaslowerthaninmeiosisstage.
Keywords:
Thesamegenotype;Differentploidy;Chinesecabbage;Biologicalcharacter;Geneexpression
缩略词表
Abbreviations
缩略符号
Abbreviation
英文全称
FullnameinEnglish
中文名称
NameinChinese
BA
Benzylaminopurine
苄氨基腺嘌呤
bp
BasePair
碱基对
cDNA
CompiementraryDNA
互补DNA
CH
CaseinAcidHydrolysate
水解酪蛋白
dNTP
DeoxyriboNucleosideTriphosphat
脱氧核糖核苷三磷酸
EDTA
EthyleneDiaminetetraceticAcid
乙二胺四乙酸
MS
MurashigeandSkoog
MS培养基
NAA
1-NaphthaleneaceticAcid
萘乙酸
PCR
PolymeraseChainReaction
聚合酶链式反应
qPCR
Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem
实时荧光PCR
Taq
DeoxyriboNucleosideTriphosphat
DNA聚合酶
TBE
ThermosaquaticusDNApolymerase
TBE缓冲液
Tris
Trihydroxymethy1Aminomethane
三羟甲基氨基甲烷
RNA
RibonucleicAcid
核糖核酸
1引言
1.1多倍体的产生与鉴定
1.1.1多倍体的产生途径
1.1.1.1自然产生多倍体
自然产生多倍体有两种途径：
自然环境诱导加倍和细胞染色体加倍。
自然条件下，由于环境的异常，如空气、温度等剧烈变化，可以产生多倍体[1]。
40℃条件下将授粉后的玉米存放24h后，对其后代进行鉴定后发现存在一定比例的四倍体、八倍体突变苗[2]。
国外也有研究发现，40℃高温下将小麦的幼胚短暂暴露就可以诱导形成多倍体幼苗[3]。
有后绿标志的自然突变体C899-J2四倍体甜瓜，就是从二倍体甜瓜品种“PlantersJumbo”发现的[4-5]。
细胞染色体加倍的途径主要分为体细胞染色体加倍和天然有性杂交后染色体加倍[1-3]。
体细胞染色体加倍主要是由于有丝分裂异常引起的，自然条件下处于有丝分裂的细胞由于不能形成纺锤丝，导致染色体不能被牵引移到细胞的两极，从而导致染色体加倍。
体细胞染色体加倍后，可能形成嵌合体，也可能形成完全的多倍性孢子体[6]。
天然有性杂交导致的染色体加倍现象主要有多精受精和未减数配子融合两种途径[3]。
多精受精是指多个精子同时进入了卵细胞的现象，这种现象在向日葵等多种植物中均有发现[7]。
未减数配子也称2n配子，是指小孢子和大孢子发生期，由于减数分裂异常形成的不正常配子。
未减数配子受精结合后，合子染色体数量加倍从而形成多倍体。
1.1.1.2人工诱变产生多倍体
自然条件下可以产生多倍体，但其变异率很低，不能被广泛地利用，人工诱变可以解决这个问题。
人工诱变产生多倍体的方法有很多，主要有：
物理诱变法，化学诱变法，体细胞无性变异途径，组织培养结合化学诱变法、体细胞杂交法[8]。
常用的物理方法主要是辐射、高速离心力、异常高温、高真空、机械创伤等。
辐射主要是各种射线（X射线、Y射线、P射线）、中子、紫外线等。
辐射诱导危害性较大、诱导效率低、嵌合率高，这主要是因为辐射会引起染色体的断裂、损伤、丢失等[9]。
太空搭载诱变也是诱导多倍体产生的一种途径，太空特殊的、地面无法模拟的环境（高真空、宇宙高能离子辐射、宇宙磁场、高洁净）可以产生诱变作用，但其重复性较差、稳定性不高，难以在实践中应用。
人工诱导剂的种类有很多，主要有：
秋水仙碱、乙醚、氟乐灵、水合三氯乙醛、哥罗仿等[10]。
其中秋水仙素使用最多、效果较好。
秋水仙素是百合科植物秋水仙中含有的一种植物碱，其化学式为C22H25O6N。
秋水仙素主要作用时期是细胞分裂中期，它可以破坏中期时纺锤丝的形成，使得一分为二的染色体不能移向细胞两极，使得应为两个细胞的染色体不能被分开，从而形成染色体加倍的细胞。
秋水仙素诱导植株加倍的主要方法有：
浸种法、滴生长点法、生长点涂抹法等。
用同一浓度秋水仙素进行诱导加倍，诱导效率随着处理时间的增加而提高；当处理时间相同时，诱导效率随着秋水仙素浓度的增加而提高[11]。
但是随着处理时间和处理浓度的增加，植株受伤程度加剧，植株成活率下降[12-13]。
这一方面与秋水仙素对植株的毒性有关，另一方面是由于诱导过程中产生了高倍体和非整倍体，使得植株死亡[14]。
因此诱导的关键是获得较高诱导率的同时保证植株正常生长。
选择最适合的处理浓度和处理时间可以高效诱导多倍体的产生。
用浓度为0.2%的秋水仙素处理辣椒幼苗，获得了较高诱导率的四倍体植株[15]。
对二倍体西瓜进行秋水仙素滴生长点处理，得到了多倍体西瓜，且变异株率为50%以上[16]。
刘惠吉等用秋水仙素处理白菜幼苗，得到了四倍体白菜和耐寒四倍体黑菜[17-18]。
研究表明通过对大白菜生长点的处理也获得了同源四倍体大白菜[19]。
组织培养过程中，无性系变异会出现自然加倍从而获得多倍体再生植株。
关于体细胞无性变异获得多倍体的研究很多，Adelberg等从来源于子叶、真叶、原生质的甜瓜愈伤组织的再生植株中获得了大量的四倍体甜瓜植株[20-21]。
在甜瓜组织培养过程中，四倍体细胞所占比例增加，四倍体再生植株约占再生植株总数的三分之一[22-23]。
对西瓜子叶进行离体培养时，在芽再生培养基中加入BA后会诱导产生四倍体，且诱导频率可达到40%-50%[24]。
对自交后30d的黄瓜未成熟种子进行离体培养，可以得到四倍体植株且诱导率为23.7%。
马国斌[25]等对西瓜和甜瓜外植体进行离体培养也获得了较高频率的四倍体植株。
利用组织培养和化学诱变结合的方法诱导多倍体，诱变条件易于控制，可以反复大批量处理植株，并且能够有效地减少异倍性嵌合体产生，成功率较高[26-27]。
另外，利用组织培养和化学诱变结合的方法诱导多倍体，倍性鉴定更简便易行，选出的多倍体植株可以迅速进行大量繁殖，且繁殖的种苗具备无病虫害、质量好、纯度高等优点，因此组织培养结合化学诱变法有着十分广阔的前景[28]。
组织培养结合化学诱变法中应用最多的是组织培养过程中利用秋水仙素对组培苗进行诱导，主要有组织培养中用秋水仙素处理材料和在加有秋水仙素的培养基中培养材料两种方法[29]。
在组织培养条件下，将金荞麦无菌苗浸泡于秋水仙素溶液中或是接于含有秋水仙素的培养基上一段时间后，均诱导产生了金荞麦多倍体植株，且浸泡法诱导率最高可以达到43.4%[28]。
体细胞杂交法即原生质体融合法，通过人为条件控制，使基因型不同的两个细胞原生质体进行融合从而获得具有重组子的过程，融合后的重组中同时具有双亲的染色体组。
随着原生质体融合技术的成熟，利用体细胞杂交的方法培养多倍体已经可以实现。
原生质体融合的方法克服了植物远缘杂交障碍，是创制多倍体的一种途径[3]。
1.1.2多倍体的鉴定
1.1.2.1间接鉴定
多倍体植株由于染色体组的加倍，引起了植株形态和生理上的变化，因此可以根据植株的特征特性来间接鉴定倍性。
周元昌[30]以抱子甘蓝的花培苗群体作为材料，通过形态学鉴定法将群体中的单倍体与二倍体、四倍体与其它倍体分开。
参照DNA流式细胞仪鉴定的结果，分析得出用苗期形态学鉴定法鉴定倍性，准确率可以达到94.2%。
间接鉴定法还可以通过植物的解剖特征、生理生化指标、细胞水平、分子水平鉴定等方法进行[29]。
施先锋[31]通过观察叶片气孔的保卫细胞数目鉴定西瓜染色体的倍性，准确率可以达到90.2%。
通过间接方法鉴定植物倍性的方法较为简便、快速、且成本较低，但仍有部分植株不能准确地被鉴定出来。
因此，间接鉴定法常被用来作为辅助鉴定倍性的方法。
1.1.2.2直接鉴定
间接鉴定可初步筛选出多倍体，但是要进一步证实确定倍性还需要依靠直接鉴定的方法。
染色体计数与组型分析是鉴定染色体倍性的传统方法，通过观察植物根尖生长点细胞、花粉母细胞的染色体数目来确定植物的倍性。
染色体计数法是最为可信的鉴定倍性的方法，但要达到准确鉴定倍性的目的，对染色体制片以及取材时间、部位等技术环节要求较高，若需要对大量样品进行鉴定时，这种方法就表现出了很大的局限性[32]。
流式细胞术（FlowCytometry）是20世纪发展起来的一种技术，由于倍性的增加，细胞内DNA含量成倍性增加趋势，因此可以用来快速鉴定倍性。
流式细胞仪测定法不受取材的限制，灵敏度高、准确性高、测试速度快、可以用来测定大量的样品。
目前流式细胞仪测定法已经普遍应用于菊花[33]、辣椒[34]、苹果[35]、黑麦草[32]等植株倍性的鉴定上。
1.1.2.3本研究中相同且纯合基因型的不同倍性大白菜的获得与鉴定
本研究以游离小孢子培养获得大白菜单倍体植株为材料，进一步利用秋水仙素诱导，二倍体与四倍体杂交的方法，以创制来自同一单倍体的相同且纯合基因型的不同倍性大白菜，利用叶片保卫细胞大小、流式细胞术和根尖染色体计数的方法对不同倍性材料进行鉴定。
获得了相同且纯合基因型的单倍体、二倍体、非整倍体、四倍体大白菜，最大化消除了基因型差异和杂合基因等对研究不同倍性材料间差异造成的影响。
1.2不同倍性植株特征特性研究
随着染色体数目成倍的增加，不同倍性材料的核质比例会发生变化，基因的互作效应、剂量效应等会破坏原有的生理
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