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18第18章基因工程基础
第18章基因工程基础
一、教学大纲基本要求
用工具酶、克隆载体与表达系统；基因克隆的一般原理与过程，目的基因的分离，目的
基因的克隆；克隆基因的表达；因表达的控制元件，外源基因在原核系统中的表达；外源基因在真核系统中的表达。
二、本章知识要点
（一）基因工程概念
基因工程是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。
基因工程的核心技术是DNA重组。
蛋白质工程是在基因工程基础上发展起来的，它是指通过对蛋白质已知结构与功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。
基因工程开辟了生物学研究的新纪元。
借助基因工程，分子生物学的发展达到空前的速度和规模，新的研究领域不断被开拓。
“人类基因组计划”是生物学历史上最巨大的科学工程；后基因组的时代已经到来。
基因工程带动了生物技术产业的兴起。
制药、化工、食品、农业和医疗保健业无不得益于基因工程。
基因工程帮助人类认识和改造生命世界，也帮助人类认识自己。
设计和创建新的基因、新的蛋白质和生物新的性状的时代。
（二）分子克隆的基本原理
克隆（clone）意为无性繁殖系。
DNA克隆即将DNA的限制酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖，以获得相同的DNA扩增分子。
故DNA克隆为分子克隆。
1、ＤＮＡ限制酶与连接酶
DNA分子克隆，即将DNA的限制片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖，获得相同的DNA扩增分子。
切割DNA分子需要用限制性核酸内切酶。
生物来源不同但识别序列与切割序列相同的限制酶，称为同裂酶（isoschizomers）；切割产生单链末端相同的限制酶，称为同尾酶（isocaudamers）。
相容（compatibleende）的限制片段可用DNA连接酶（DNAligase）相连接。
平末端连接效率较低，利用接头（linker）、衔接物（adaptor）或在平末端加上互补均聚物可以帮助平末端连接。
合成的含限制酶识别位点的ＤＮＡ片段（接头）通常是一条回文结构（palindrome）的寡核苷酸，在溶液中自身配对成为双链片段。
例如：
EcoRI的接头为GGAATTCC；HindIII的接头为CCCAAGCTTGGG。
限制酶的切割位点靠近ＤＮＡ片段的末端时其活性将受影响，不同限制酶所受影响不同，因此限制酶的接头通常要比识别序列长，EcoRI的接头八核苷酸就足够了，而HindIII的接头十二核苷酸仍然酶切不完全。
当合成的片段含有不只一种限制酶的识别序列，则称为多接头（polylinker）。
如果合成两条互补的寡核苷酸，使其配对后一端为平末端，另一端为粘性末端，或两端为不同的粘性末端，此合成的片段称为衔接物。
衔接头可以使ＤＮＡ片段的平末端转变为粘性末端，或由一种粘性末端转变为另一种粘性末端，并且无需用限制酶切，在基因工程中十分有用。
2、分子克隆的载体与宿主系统
将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具，称为载体（vector）。
克隆载体通常是由质粒、病毒或一段染色体DNA改造而成。
大肠杆菌载体主要有：
质粒载体、λ噬菌体载体、柯斯质粒和丝状噬菌体M13载体等，它们能够携带的外源DNA片段大小不同，用途也各异。
宿主细胞根据载体的性质来选定。
将外源DNA导入宿主细胞，从而改变细胞遗传性状，称为转化；将病毒DNA直接导入细跑，称为转染。
用氯化钙处理大肠杆菌细胞，使处于感受态，可以促进转化。
λ噬菌体和柯斯质粒的重组体在体外包装后可用以感染大肠杆菌，柯斯质粒在大肠杆菌细胞内以质粒形式存在。
外源DNA导入真核细胞常用DNA复合物、脂质体、电穿孔等方法。
3、基因文库的构建
基因文库是指整套基因组DNA片段分子克隆的总体。
基因文库的构建包括基因组DNA的随机片段化、载体DNA的制备、重组体DNA的体外包装、重组噬菌体感染大肠杆菌、基因文库的鉴定和扩增等步骤。
由于真核细胞的基因是断裂的，只有用它的mRNA经逆转录获得cDNA，才能得到连续的编码序列。
细胞全部mRNA的cDNA克隆之总体，称为cDNA文库。
从文库个筛选基因或cDNA克隆主要依据重组体的特征、原位杂交或表达产物的性质。
4、聚合酶链反应
聚合酶链反应（PCR）借助一对引物，在耐热DNA聚合酶作用下，通过多轮酶促反应，使基因序列得到指数级的扩增。
PCR技术因其检测和扩增基因十分快速高效，并互简单易行，而被广泛用于生物学、医学、刑侦和其他有关领域。
（三）克隆基因的表达调控
基因表达的主要控制元件有：
启动子和有关的调控序列、核糖体结合位点、转录终止信号和终止密码子等。
外源基因在宿主细胞内可以非融合蛋白形式表达，也可以融合蛋白形式表达。
在信号肽的引导下表达蛋白可以穿过细胞膜，分泌到细菌的周质或培养基中。
外源蛋白较高水平表达时常产生不溶性的包涵体。
为便于操作，真核生物表达载体通常都含有在大肠杆菌中复制的起点，因此都是穿梭载体。
酵母菌的克隆和表达载体常用整合质粒、附加体质粒、复制质粒构建而成。
为克隆基因组DNA大片段，常用酵母人工染色体（YAC）。
植物基因工程最常用的载体是Ti质粒。
高等动物常用各种病毒构建表达载体。
蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然后依赖基因工程获得突变型蛋白质。
蛋白质的实验进化为蛋白质改造提供了又一条有效途径。
蛋白质工程已成为研究蛋白质结构和功能最重要的手段之一，并在改进和开发蛋白质产品中日益发挥重要作用。
、重点、难点
重点：
基因克隆的一般原理与过程，目的基因的分离与克隆；克隆基因的表达；常
用的基因工程工具酶和载体。
难点：
工具酶性质和特点、克隆载体的结构和多克隆位点，基因表达系统及控制元件，
外源基因在原核系统和真核系统中表达的载体构建。
、典型例题解析
例题18-1：
如何理解基因工程的两个特点？
解：
基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达。
分子水平的操作包括DNA分离、切割和连接（还有其他一些起DNA的修饰等）。
由于体外重组DNA的最终目的是要改变生物的遗传性，所以分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点。
例18-2:
什么是klenow酶？
有哪些活性？
在基因工程中有什么作用？
解：
Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'→3'聚合酶和3'→5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'→3'外切核酸酶活性。
由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'→3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。
Klenow酶主要有下列用途：
（1）修复反应，制备平末端
可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其它方法产生的5’或3’突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。
如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。
用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；而修复3’突出末端则是用Klenow酶的5'→3'外切核酸酶的活性，是切割反应。
用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。
（2）标记DNA3’突出末端（protrudingend）
该反应分两步进行：
先用5'→3'的外切核酸酶活性除去3’突出末端，产生3’隐含末端，然后在高浓度的标记底物（α-32p-dNTP）存在下，使降解（5'→3'）作用与聚合（5'→3'）作用达到平衡。
这种反应也叫交换或取代反应（exchange／replace-mentreaction）。
不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的5'→3'外切核酸酶活性较强。
（3）其他的一些用途：
包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法（primerextension）制备单链DNA探针等。
例18-3:
YAC载体具有什么样的功能DNA序列？
为什么克隆大片段时，YAC具有优越性？
解：
YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。
YAC能够容纳长达几百Kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。
大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
例18-4:
由于基因工程人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的，请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面？
解：
（1）非传递性和不被带动转移。
对于多数基因克隆操作来说，都不希望载体能够进行自主传递，也不希望带动转移。
（2）具有条件致死突变，如温度敏感质粒pJC307（ColE1的衍生质粒）在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中。
（3）一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后有可能给宿主带来突变。
（4）有较小的宿主范围。
例18-5:
有人用限制性内切核酸酶EcoRⅠ分别切割松弛型质粒ColE1和严紧型质粒pSC101（各一个切点），然后重组连接形成一个杂种质粒pSC134，请推测这种质粒有什么特性和用途。
解：
由于ColE1不能在缺失DNA聚合酶Ⅰ的细菌中复制，所以在这种细菌中就使用pSC101的复制起点。
而质粒pSC101不能在不合成蛋白质的细胞中复制，在这种情况下则使用ColE1的复制起点。
一般情况下优先使用ColE1的复制起点。
这种质粒由于具有两个复制起点，可以根据需要，选用不同的宿主菌，表达特定的外源基因。
例18-6:
YAC克隆载体常出现哪些问题？
解：
（1）YAC有嵌合现象，一个YAC中克隆的DNA片段可能来自两个或多个不同的染色体。
在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的5％~50％。
由特定的染色体构建的文库，嵌合体占克隆总数的5％~15％；
（2）YAC内部有重组现象，插入的DNA较大，序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一致，重组很难检出。
（3）YAC还有缺失现象，影响YAC文库的代表性。
（4）YAC结构和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC和酵母天然染色体分开。
（5）构建好的YAC转化原生质化的酵母菌，转化效率低。
（6）建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大。
例18-7:
什么是蓝白斑筛选法？
解：
这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。
主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β-半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-引哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）平板上形成浅蓝色的噬菌斑。
外源基因插入lac基因（或lac基因部分被取代）后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-引哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。
例18-8:
以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体？
解：
改造的置换型噬菌体载体，重组入外源片段之后，总体积不能超过λ基因组的105%，不能少于λ基因组的75%。
以置换型λ噬菌体DNA作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA重组。
如果没有外源片段仅是两臂连接，长度短于λ基因型的75%，不能被包入噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。
如果插入了外原片段后，总长度超过λ基因组15%后，也不能包入噬菌体颗粒，自然不能形成噬菌斑。
例18-9:
PCR的基本原理是什么？
PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？
解：
（1）DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。
（2）至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。
例18-10:
在DNA分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么？
解：
原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA，最终不能除去酚，残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酶和连接酶变性。
氯仿也是蛋白质性剂，它不与水互溶，但是能够同苯酚互溶，这样，酚和氯仿联合使用，就可以带走残留的酚。
例18-11:
什么是基因组文库（genomiclibrary）？
构建基因组文库，涉及哪些基本过程？
它同遗传学上的基因有什么不同？
解：
基因型文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。
一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作载体，包括下列过程：
（1）高分子量染色体DNA的制备；
（2）体外重组连接；（3）包装蛋白的制备；（4）重组体的体外包装；（5）将重组DNA导人寄主细胞；（6）筛选。
基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。
基因库（genepool）是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。
在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。
例18-12:
什么是cDNA文库（complementDANlibrary）？
同基因组文库有何差别？
解：
同mRNA互补的DNA称为cDNA。
cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA，即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA称为cDNA。
选用适合的载体，将合成的cDNA重组导人寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。
由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。
由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。
所以，cDNA文库是不可能构建得十分完全，也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。
cDNA文库与基因组文库的主要差别是：
（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因；
（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响；
（3）基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；而cDNA克隆的是不含内含子的基因。
例18-13:
插入失活和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么？
解：
主要差别是：
插入失活法是直接根据失活基因的表型变化来筛选重组体；插入表达是根据一个基因的失活引起另一个基因的表达变化来选择。
例18-14:
一个携带有氨苄与卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中的识别位点的EcoRI消化。
消化物与酵母DNA连接后转化对两种抗生素都敏感的E.coli菌株。
⑴利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞？
⑵怎样区分接受了插入酵母DNA的质粒的克隆？
解：
（1）选择Ampr的转化子；
（2）所需的克隆是Ampr和Kans。
任何能够抗这两种药物的克隆都是自连的非重组质粒。
例18-15:
建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆？
解：
带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来，因为基因表达引起了宿主细胞表型的可见变化。
然而，真核生物的基因不都表达，则需用相应的方法来找出带有所需基因特定克隆。
一个常用方法是杂交（图21-5）：
（1）从不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纤维素滤膜上，然后用NaOH使之变性。
（2）探针必须能与所需的基因互补且被32P标记。
探针可以是来自另一不同生物体的相关的基因，或是依据与基因特异相关蛋白质的氨基酸序列设计并经化学合成的一小段DNA分子。
（3）探针只会与特定基因进行碱基配对（杂交），冲洗滤膜后，未结合上的标记探针会被除去。
（4）烘干滤膜后进行放射自显影后，所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来，这就是菌落或原位杂交分析。
例18-16:
蛋白质结构改造的分子设计依据是什么？
解：
分子设计主要依据三个方面的知识：
①蛋白质分子间的进化关系，从同源蛋白质序列的微观差异可找出其对空间结构和生物功能的影响；另一方面蛋白质的进化研究也为蛋白质的构造规则提供了信息。
②蛋白质一级结构与空间结构的关系，由此可以从一级结构预测三级结构。
③蛋白质结构与功能的关系，找出结构改变对功能的影响。
五、单元自测题
（一）名词解释
1.遗传工程2.生物技术3.基因工程4.细胞工程5.蛋白质工程6.分子克隆7.载体8.转化
和转染9.基因文库10.cDNA文库
（二）填空
1．自然界的常见基因转移方式有、、、。
2．不同DNA分子间发生的共价连接称为，有、两种方式。
3．基因工程的载体必须具备的条件有、、。
4．基因工程常用的载体DNA分子有、、和。
5．一个完整的DNA克隆过程应包括、、、、
。
6．目的基因获取的途径或来源有、、、。
7．基因工程过程中重组体直接筛选法的方式有、、。
8．基因克隆真核生物表达体系常见的有、、表达体系。
9．根据重组体DNA的性质不同，将重组体DNA导入受体细胞的方式有、、等。
10．如果M13的外源基因被插入到lacZ基因内，则在含有X-gal的培养基上生长时会出现色菌落，如果在lacZ基因内无外源基因插入，在同样的条件下呈现色菌落。
11．当细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，就可以从一个细胞（细菌）转移到另一细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为作用。
12．重组DNA技术中常用的工具酶有、、、。
（三）选择题
1．下列那种方式保证了免疫球蛋白的多样性?
A.转化B.转染C.转位D.转导
2．微切割技术使目的基因可来源于下列那种物质?
A.真核细胞染色体DNAB.人工合成DNAC.cDNAD.G-文库
3．重组DNA技术中常用的工具酶下列那项不是：
A.限制性核酸内切酶B.DNA连接酶C.DNA聚合酶ID.RNA聚合酶
4．DNA致癌病毒感染宿主细胞后，使之发生癌变是因为发生了：
A.转化B.转导C.接合D.转座
5．关于基因工程的叙述，下列哪项是错误的?
A.基因工程也称基因克隆
B.只有质粒DNA可作为载体
C.重组体DNA转化或转染宿主细胞
D.需获得目的基因
6．有关质粒的叙述，下列哪项是错误的?
A.pBR322含有β-半乳糖苷酶的α片段基因
B.质粒较易转化
C.质粒的遗传表型可作为转化子的筛选依据
D.pBR322的分子中仅有一个E.coRI内切酶位点
7．下列哪项不是重组DNA的连接方式?
A.粘性末端与粘性末端的连接
B．平端与平端的连接
C.粘性末端与平端的连接
D.人工接头连接
8．有关噬菌体的叙述哪项不符合?
A.感染大肠杆菌时仅把DNA注入大肠杆菌内
B.只有裂解一种生活方式
C.溶源和裂解两种生活方式可以相互转变
D.噬菌体是由外壳蛋白和DNA组装而成
9．DNA克隆不包括下列哪项步骤?
A.选择一个适合的载体
B.重组体用融合法导入细胞
C.用连接酶连接载体DNA和目的DNA，形成重组体
D.用载体的相应抗生素抗性筛选含重组体的细菌
10．下列哪项不能作为表达载体导人真核细胞的方法?
A.磷酸钙转染B.电穿孔C.脂质体转染D.氯化钙转染
11.下列哪项不能作为基因工程重组体的筛选方法?
A.PCR技术
B.宿主菌的营养缺陷标志补救
C.抗药性标志选择
D.Southern印迹
12．关于转化错误的是：
A.受体细胞获得新的遗传表型
B.外源DNA一定整合进受体细胞基因组
C.自然界中较大的外源DNA转化几率较低
D.自然界中较大的外源DNA转化几率较高
13．下列哪种酶是重组DNA技术中最重要的?
A.反转录酶B.碱性磷酸酶C.DNA连接酶D.DNA聚合酶I
14．在分子生物学中，基因克隆主要指：
A.DNA的复制B.DNA的转录C.DNA的剪切D.RNA的转录
15．在分子生物学中，重组DNA又称为：
A.酶工程B.蛋白质工程C.细胞工程D.基因工程
16．cDNA是指：
A.在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA
B.在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA
C.在体外经反转录合成的与RNA互补的RNA
D.在体内经反转录合成的与RNA互补的RNA
17．聚合酶链式反应常常缩写为：
A.PRCB.PERC.PCRD.BCR
18．在已知DNA序列的情况下，获取目的基因的最方便的方法是：
A.人工化学合成B.基因组文库法C.cDNA文库法D.PCR法
19．用于PCR反应的酶是：
A.DNA连接酶B.TaqDNA聚合酶C.逆转录酶D.碱性磷酸酶
20．在cDNA技术中，所形成的发夹环可用
A.限制性内切核酸酶切除B.用3′外切核酸酶切除
C.用S1核酸酶切除D.用5′外切核酸酶切除
21，cDNA文库包括该种生物的
A.某些蛋白质的结构基因B.所有蛋白质的结构基因
C.所有结构基因D.内含子和调控区
22．关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?
A.具有可诱导性B.具有可转移性
C.细菌生长的任何时期都可以出现D.不同细菌出现感受态的比例是不同的
23．在简并引物的3′端尽量使用具有简并密码的氨基酸，这是因为
A.Taq酶具有一定的不精确性B.便于排除错误碱基的掺人
C.易于退火D.易于重组连接
24．变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNA分离，原因主要是
A.氧化物会改变pH值B.氧化物可使DNA的磷酸二酯键断裂
C.氧化物同DNA形成复合物D.氧化物在DNA分离后不易除去
（四）是非题
1.基因表达的最终产物都是蛋白质。
2．因为密码子是不重叠的，所以基因也是不重叠。
3．基因有两条链，与mRNA碱基序列相同（仅T代替了U）的链称为正链。
4．RNA是基因表达的第一产物。
5.在细菌中，一些酶的合成有赖于这些酶的基因的连续表达。
6．原核生物中tRNA基因的转录是由RNA聚合酶Ⅲ完成。
7．毫无例外，从结构基因中的DNA序列可以推出相应的蛋白质序列。
8．蛋白质的氨基酸序列是由基因的编码区核苷酸序列决定的，只要将基因的编码序列转入细胞，就能合成相应的蛋白质。
9．利用基因工程的手段，包括基因的定点突变等改造蛋白质分子，使之具有更完善，更符合人类要求的功能，这种技术和学科被称之为蛋白质工程。
10．基因工程的特点是在分子水平上操作，在细胞水平上表达。
11．DNA连接酶常用来连接载体DNA和外源性DNA。
12．质粒不能在宿主细胞中独立自主地进行复制。
（五）问答题
1．什么叫基因克隆?
简述基因克隆的步骤。
2、基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的？
3．简述重组DNA技术中目的基因的获取来源和途径。
4．简述互补筛选重组体质粒细菌的原理。
5．基因工程中重组体筛选的方法有哪些?
6．基因工程
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