雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱研究.docx
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雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱研究
专业：
药物分析
雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱研究
高旋*，庄莹，宋敏，翟清波，杭太俊
（中国药科大学药物分析教研室，南京210009）
摘要目的：
建立雷公藤药材及制剂的HPLC指纹对照测定法，为雷公藤质量控制提供参考。
方法：
采用C18色谱柱，甲醇-水为流动相梯度洗脱，测定雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱，统计分析确定共有模式；以最接近共有模式的雷公藤药材和制剂为指纹对照，采用夹角余弦法和相对欧氏距离法，分别从化学成分定性和含量两个方面对不同产地雷公藤药材和主要市售雷公藤片剂的HPLC指纹图谱进行定性与定量相似性评价。
结果：
建立的雷公藤药材及制剂的HPLC指纹图谱测定条件分离良好、专属性强，可用于全面控制雷公藤的质量。
结论：
以指纹对照品为参照进行雷公藤药材及制剂指纹图谱相似性评价，重复性和耐用性良好。
测得雷公藤药材及制剂的指纹特征差异显著。
关键词：
雷公藤药材；雷公藤片剂；雷公藤内酯醇；指纹图谱；高效液相色谱法
StudyofTripterygiumwilfordiiHook.fandtripterygiumtabletsbyHPLCFingerprintChromatogram
GAOXuan,ZHUANGYing,SONGMin,ZHAIQing-bo,HANGTai-jun
（ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China）
AbstractObjective:
ToestablishastableandrepeatableHPLCreferencefingerprintchromatogramstandardforthequalityanalysisandcontrolofTripterygiumwilfordiiHook.f.anditspreparations.Methods:
HPLCseparationwasperformedonaC18columnwithmethanol-waterasmobilephaseinagradientelutionmode.ThereferencefingerprintchromatogramwasdeterminedasthemosttypicalchromatogramthatrepresentedmostpropertiesofTripterygiumwilfordiiHook.f.andtripterygiumtablets,respectively,frombothconstitutesandquantityviewofpoints,establishedbystatisticalandsimilarityanalyses.Results:
TheresultsindicatethatthequalityassessmentsofTripterygiumwilfordiiHook.f.andtripterygiumtabletswithreferencetotheconcomitantlymeasuredHPLCreferencefingerprintchromatogramshavegoodruggedness,specificity,andreproducibility.Conclusion:
ThefingerprintchromatogramsofTripterygiumwilfordiiHook.f.anditspreparationscanbequantitativelyandqualitativelyevaluatedbycomparisonwiththeestablishedfingerprintreferencestandardsbyusingCosineandrelativeEucliddistancemethods,respectively.ThefingerprintchromatogramsofbothTripterygiumwilfordiiHook.f.anditspreparationsvariessignificantly.
Keywords:
TripterygiumwilfordiiHook.f.;tripterygiumtablets;triptolide;fingerprintchromatogram;HPLC
雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.f.）系卫矛科雷公藤属植物，产于浙江、安徽、江西、湖南、广东、广西、福建、云南等地，同属植物还包括昆明山海棠（TripterygiumhypoglaucumHutch）、东北雷公藤（TripterygiumregeliiSpragueetTakeda）。
雷公藤是一味传统中药，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗生育等活性[1]，这些作用是由其所含的二萜和三萜内酯、及生物碱等多种成分的协同作用所产生的[2]。
雷公藤多苷是从卫矛科植物雷公藤根中提取出来的一些次代谢物的混合体,具有抗炎和免疫抑制作用，在临床上雷公藤多苷片广泛用于治疗类风湿性关节炎[3]，并在抗肿瘤方面具有良好的应用前景[4]，其抗生育活性也曾受到关注[5]。
但是，雷公藤药材和制剂都有明显的毒副作用，临床安全使用的治疗剂量较小、治疗窗较窄，药材、分离制备工艺、服用剂量不合理等多种因素都会导致服药后的毒性反应[6]。
尽管已有大量的雷公藤化学成分的分离鉴定研究和雷公藤内酯（雷公藤多苷）的药理研究报道[2,6~9]，但是临床上广泛使用的“雷公藤多苷”产品大都仅对所含的雷公藤内酯醇（雷公藤甲素）或雷公藤酯甲进行测定控制[10~12]，中药成方制剂标准[13-14]中分别以雷公藤酯甲与雷公藤内酯醇作为指标，使用薄层扫描法进行测定，控制指标准确性较差。
其化学成分的整体系统分析控制研究和实际应用很少，仅见有对雷公藤叶提取物指纹图谱的报道[15]。
中药指纹图谱是目前已被国内外广泛接受的一种天然药物质量评价模式，本文以“指纹对照品对照”[16]，分别采用夹角余弦法和相对欧氏距离法[17]从化学成分定性和定量两个方面对雷公藤药材及其制剂进行雷公藤内酯整体质量进行多指标化学成分分析控制，为雷公藤制剂质量的整体控制提供参考，以保障临床用药的安全。
1仪器与试药
Shimadzu2010高效液相色谱仪（日本岛津公司），LCSolution色谱数据工作站（日本岛津公司）；Satorious电子分析天平（德国赛多利斯股份公司）；KQ3200E医用超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷和石油醚均为分析纯（南京化学试剂厂）；中性氧化铝（100~200目）；水为重蒸水。
雷公藤药材为TripterygiumwilfordiiHook.f.的干燥根及根茎，分别于2007～2008年购自广西、福建、四川、浙江、湖南等地，由南京师范大学生命科学院龚祝南教授鉴定（见表1）。
雷公藤片剂：
市售（见表2）。
雷公藤内酯醇（批号111567-200502）、雷公藤酯甲（批号111597-200402）对照品分别购自中国药品生物制品检定所。
表1雷公藤药材来源
Tab.1OriginofTripterygiumwilfordiiHook.f.
表2雷公藤多苷片来源
Tab.2Originoftripterygiumtablets
2溶液的制备
2.1药材供试品溶液的制备取雷公藤药材粉末（过40目筛）约5.0g，精密称定，加无水乙醇100ml，浸泡过夜后水浴加热回流2h，慢速滤纸抽滤，用20ml无水乙醇分次洗涤残渣，合并滤液，将滤液于50℃水浴减压旋转蒸发至干，精密加入无水乙醇20ml复溶，定量移取15ml，置中性氧化铝柱[中性氧化铝5.0g，柱内径0.8～1.0cm，用石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1:
4）5mL预洗]上，用石油醚-乙酸乙酯（1:
4）50mL洗脱，收集洗脱液，于45℃水浴减压旋转蒸发至干，残留物精密加入1ml甲醇-水（80:
20）溶解，用微孔滤膜（0.45µm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2制剂供试品溶液的制备取雷公藤片剂10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取细粉约0.5g，精密称定，置25mL量瓶中，加无水乙醇约20mL，密塞，超声处理（120W，40kHz）60min，冷至室温，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液15mL，置中性氧化铝柱[中性氧化铝1.0g，柱内径0.8～1.0cm，用石油醚-乙酸乙酯（1:
4）5mL预洗]上，用石油醚-乙酸乙酯（1:
4）30mL洗脱，收集洗脱液，于45℃水浴减压旋转蒸发至干，后续步骤同“2.1”项。
3指纹图谱的建立
3.1色谱条件与系统适用性用PhenomenexLunaC18（4.6mm×250mm,5µm）色谱柱，甲醇（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱：
0min（A40%）→120min（A70%）；流速1.0mL·min-1；检测波长218nm；柱温为35℃。
在上述色谱条件下，雷公藤内酯醇色谱峰与相邻色谱峰分离度大于1.5。
3.2测定方法精密量取供试品溶液20µL，注入色谱仪，记录色谱图。
以雷公藤内酯醇的保留时间和峰面积为参比计算各指纹峰的相对保留时间（α）和相对峰面积（AR%）。
按夹角余弦和相对欧氏距离法分别计算指纹图谱定性和定量相似度。
3.3特征峰的确定分别测定各批雷公藤药材和制剂的HPLC指纹图谱，经比较分析后确定药材指纹共有峰32个，制剂共有峰30个。
图1为雷公藤药材和制剂的典型HPLC指纹图谱和空白样品色谱图。
选择主要特征有效成分雷公藤内酯醇峰为参照峰（s峰）。
图1HPLC指纹图谱（A）雷公藤药材，（B）雷公藤片
Fig.1HPLCFingerprintchromatogramsof（A）TripterygiumwilfordiiHook.f.and（B）tripterygiumtablets
3.4方法验证在“2.1”项的条件下制备福建药材供试样品，在“2.2”项的条件下制备上海复旦复华药业有限公司生产的雷公藤片剂（批号070302）为制剂供试样品。
对同一供试品溶液，连续测定6次，考察精密度；对同一供试品溶液分别放置0，2，4，6，12，24h分别测定，考察稳定性；取同一批供试品，制备供试品溶液6份，分别测定，考察重复性。
结果表明：
以雷公藤内酯醇为参比，药材和制剂各指纹色谱峰的相对保留时间和相对峰面积重复性良好，RSD均小于5.0%，符合指纹图谱的要求。
4特征成分含量测定
4.1雷公藤内酯醇含量测定
4.1.1对照品溶液的制备精密称取雷公藤内酯醇对照品适量，加甲醇溶解，制成每1mL含雷公藤内酯醇44µg的对照溶液。
4.1.2线性关系精密称取雷公藤内酯醇对照品适量，少量甲醇溶解后用甲醇-水（80:
20）定量逐级稀释配制成浓度分别为8，16，40，80，和160mg·L-1的系列标准溶液，在“3.1”项色谱条件下测定，以质量浓度（C，mg·L-1）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标进行线性回归。
结果表明，雷公藤内酯醇进样浓度在8~160mg·L-1范围内有良好的线性关系，回归方程为：
A=4.304×104C+2.091×104r=0.9999。
4.1.3回收率精密称取福建产地药材和南京军区南京总医院（批号060530）已测知雷公藤内酯醇含量的样品各9份，分别加入相当于样品中已知量80%，100%和120%的对照品溶液（44µg·mL-1）后分别照“2.1”项和“2.2”项下方法制备药材及制剂回收率测定用样品溶液，低、中、高浓度各3份，在“3.1”项色谱条件下测定，结果见表3。
平均回收率及RSD均符合中药质量控制的要求。
表3雷公藤内酯醇加样回收率结果
Tab.3Theadditionrecoveryoftriptolide
4.1.4样品测定分别按“2.1”项和“2.2”项下方法制备雷公藤药材（见图2）和雷公藤片剂（见图3）供试品溶液，在“3.1”项色谱条件下测定，以外标标准曲线法计算各产地、厂家供试品溶液雷公藤内酯醇的含量，结果见表4。
图2不同产地雷公藤药材HPLC指纹图谱（1~8样品编号，同表1）
Fig.2FingerprintchromatogramofTripterygiumwilfordiiHook.fsamplesfromdifferentorigins（sampleNo.,sameasTab1）
图3不同厂家生产的雷公藤片剂HPLC指纹图谱（1~9样品编号，同表2）
Fig.3Fingerprintchromatogramoftripterygiumtabletssamplesfromdifferentmanufactory（sampleNo.,sameasTab2）
表4含量测定结果（平均值SD,n=3；样品编号同表1、表2）
Tab4Assayresults（meanSD,n=3;sampleNo.,sameasTab1andTab2）
5指纹图谱相似度评价
以夹角余弦为定性相似度指标，对“4.3”项下所测得8批雷公藤药材和8批雷公藤片剂样本（9号制剂与其它制剂有显著性差异，不用于共有模式建立）的指纹图谱分别以平均值法建立共有模式，以夹角余弦法和相对欧氏距离法分别进行定性和定量相似度计算，分析确定最接近共有模式的药材和制剂为指纹对照品。
结果，桂林产药材和黄石飞云制药有限公司生产的雷公藤片剂分别被确定为药材和制剂的指纹对照品。
以指纹对照品图谱为参照，分别计算各药材样本与参照之间的定性相似度（Cos）和定量相似度（Red）。
结果见表5。
结果表明，无论是不同产地的药材还是不同厂家生产的制剂，在定性和定量相似度上都有较大差异。
表5雷公藤药材和制剂的相似度计算结果（样品编号同表1、表2）
Tab.5TheresultofsimilarityofTripterygiumwilfordiiHook.f.andtripterygiumtablets（sampleNo.,sameasTab1andTab2）
6LC-MS/MS法分析雷公藤制剂化学成分
6.1供试品溶液制备分别按上述“2.1”项和“2.2”项制备福建产地药材和上海复旦复华药业有限公司样品（批号070302）供试品溶液。
6.2液相色谱条件色谱柱：
AgilentHC-C18（4.6mm×250mm,5µm）；柱温35℃；流动相A：
甲醇，流动相B：
水；梯度洗脱：
0~60min时流动相A为35%~52%，60~140min时流动相A为52%~70%，140~143min时流动相A为70%~90%，143~145min时流动相A为90%~35%，145~150min时流动相A为35%，流速：
1.0mL·min-1。
6.3质谱检测条件大气压化学离子化（APCI）正离子检测，电流8.0A，雾化温度450℃，雾化气压30psi，辅助气压力10psi，毛细管温度350℃，碰撞气氩气压力1.2mTorr，碰撞能量30eV。
采用一级离子全扫描和子离子全扫描两种方法进行测定。
对供试品溶液的LC-MS/MS全扫描质量范围分为300~400、400~500和700~950三部分。
6.4主要特征色谱峰的鉴别对供试品溶液先在液相色谱条件下取得较好分离，按照一级质谱全扫描方式获得加合离子峰的信息，图4为一级质谱全扫描的总离子流色谱图；再在30eV的碰撞能量下进行二级质谱子离子全扫描，获得的主要色谱峰的加合离子及特征碎片离子。
图4一级质谱全扫描的总离子流色谱图：
A雷公藤多苷片，B雷公藤药材
Fig.4Fullscanchromatogramofsample:
Atripterygiumtablets,BTripterygiumwilfordiiHook.f.
经过相应对照品溶液比对，1、2、14、17号峰分别为雷公藤内酯三醇、雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱，并将LC-MS/MS测定的结果与已有文献报道的化合物相对照，对主要特征色谱峰进行初步鉴别，表6列出了对应于相应质荷比可能存在的生物碱名称、特征碎片离子、分子式和分子量。
表6特征色谱峰鉴别
Tab.6Activecomponentsofchromatogram
7讨论与小结
7.1提取条件的选择提取雷公藤药材时，由提取溶剂种类、液料比、回流时间三因素设计正交试验，并结合工业生产的实际情况对试验结果进一步优化。
结果表明使用无水乙醇为溶剂，与药材比例20:
1，回流提取2h为最优条件，药材中各主要成分提取较完全。
另外，在此基础上结合文献[18]考察了制剂的不同提取方法和提取时间，由于制剂中主要成分含量较高且较易提取，最终选择了较为简便的无水乙醇超声提取方法。
7.2脱色与洗脱条件选择试验采用中性氧化铝脱色，目的是除去样品中的色素与极性杂质。
研究比较了无水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、不同比例的乙酸乙酯-石油醚等多种洗脱剂。
结果表明乙酸乙酯-石油醚（4:
1）可较好地将药材和制剂中包括雷公藤内酯醇在内的内酯类成分洗脱出来。
洗脱剂用量考察发现，洗脱剂体积分别为50mL和30mL可分别将5.0g药材及0.5g制剂样品中内酯类成分洗脱完全，并有效消除色素干扰。
7.3色谱条件的选择由于雷公藤含有的成分较多，极性差别大，HPLC等度洗脱法难以完全分离。
故采用HPLC梯度洗脱法测定，分离度高，重现性好，结果准确可靠。
雷公藤内酯醇仅有UV末端吸收，故选择218nm作为检测波长。
7.4指纹参照峰的选择雷公藤内酯醇是雷公藤药材中已知主要有效成分之一，亦是有毒成分之一，生药中也多以雷公藤内酯醇评价药材质量的好坏[19]，以其作为主要检测指标。
中药成方制剂标准中也以雷公藤内酯醇与雷公藤酯甲作为检测指标。
在建立的色谱条件下，雷公藤内酯醇色谱峰与相邻色谱峰分离度良好，且与雷公藤内酯醇相比其它成分单体对照品较难得到，故选择雷公藤内酯醇为指纹参照。
7.5雷公藤酯甲含量测定雷公藤酯甲是雷公藤三萜类的强活性代表物质，为此类制剂质量控制的另一个重要检测指标，但由于雷公藤酯甲与雷公藤内酯醇极性差异较大，很难在一定时间的梯度洗脱程序内同时检测，故本实验另外建立了测定雷公藤酯甲的方法。
色谱柱：
AgilentHCC18色谱柱（4.6mm×150mm,5µm）；流动相：
甲醇-0.1%磷酸（80：
20）；流速：
1.0mL·min-1；检测波长：
210nm；样品处理方法同上述“2.1”项和“2.2”项。
各产地药材及各厂家制剂含量测定结果见表4，结果显示无论药材还是制剂中雷公藤酯甲含量差异均较大。
7.6雷公藤药材与制剂指纹图谱比较与探讨
从指纹图谱和相似度计算结果均可看出，无论是不同产地的药材还是不同厂家生产的制剂，在定性和定量相似度上都有较大差异。
药材的差异主要是由于不同部位、不同产地、不同采收期的化学成分分布与含量的不同。
而制剂的差异除了采用的药材具有以上差异之外，不同的生产工艺是另一个主要因素。
本实验比较了药材不同部位的差别：
取浙江丽水产地雷公藤全株药材的干燥根、茎、叶分别处理测定。
结果表明：
雷公藤叶中雷公藤内酯醇含量显著高于根和茎，其它成分的含量相对较少；根中生物碱成分占绝大部分，萜类成分含量很少；茎较根而言生物碱成分含量相对较少而萜类成分含量相对较多。
因此，选取的药材部位不同或者不同部位的比例不同可能为不同厂家生产的雷公藤片剂质量差异较大的原因之一。
例如，南京军区南京总医院生产的雷公藤制剂是采用雷公藤叶提取而成，得到的指纹图谱与其它以雷公藤的根茎为原料厂家生产的雷公藤制剂的指纹图谱有很大的差异，整体轮廓上不符合共有特征，且雷公藤内酯醇含量较大,与文献报道结果相一致[15]。
即便是同一产地、相同部位的药材也会有较大差异。
采收期不同，所含化学成分及含量不同可能为主要因素。
同一产地于夏季和冬季采收的雷公藤叶提取物中主要成分，尤其是雷公藤内酯醇含量相差较大[15]。
另有文献报道[20]夏季采收的雷公藤药材毒性最大，而冬季采收的雷公藤药材毒性较小。
制剂样品6~8指纹图谱表明其生物碱成分峰数量相对较少且含量小，可能与采用雷公藤茎为原料，并在生产工艺中分离去除了生物碱成分相应。
不同厂家生产的制剂样品4和5，7和8不论定性还是定量相似度都很高，这可能与它们药材来源、部位相同，并使用相似的生产工艺相关。
由于药材部位、来源、采收期和生产工艺的不同和不稳定性，导致目前市售的雷公藤片剂质量差异较大，从而影响临床使用的有效性与安全性。
因此，建立雷公藤指纹图谱标准，可以平行地整体监控和比较产品内在质量，从而保障临床应用的有效与安全。
表1雷公藤药材来源
Tab.1OriginofTripterygiumwilfordiiHook.f.
SampleNo.
origin
species
1
Tainingcountry,Fujianprovince
TripterygiumwilfordiiHook.f.
2
Guilincity,Guangxiprovince
TripterygiumwilfordiiHook.f.
3
Yunnanprovince
TripterygiumwilfordiiHook.f.
4
Xichangcity,Sichuanprovince
TripterygiumwilfordiiHook.f.
5
Yulincity,Guangxiprovince
TripterygiumwilfordiiHook.f.
6
Chongqingcity
TripterygiumwilfordiiHook.f.
7
Chengducity,Sichuanprovince
TripterygiumwilfordiiHook.f.
8
Lishuicity,Zhejiangprovince
TripterygiumwilfordiiHook.f.
表2雷公藤多苷片来源
Tab.2Originoftripterygiumtablets
SampleNo.
manufactory
LotNo.
labledamount
1
ShanghaiFudanFuhuaPharm.Co.,Ltd.
070302
liquidextracts
10mgpertablet
2
JiangsuMeitongPharm.Co.,Ltd.
070321
liquidextracts
10mgpertablet
3
HunanXieliPharm.Co.,Ltd.
2007050
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