蛋白质组学在水果品质控制方面的应用进展.docx

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蛋白质组学在水果品质控制方面的应用进展

蛋白质组学技术在水果品质控制方面的应用进展

摘要：

蛋白质组学旨在阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。

其对生命现象的诠释直接、准确，已逐渐成为现代生物技术发展的支撑技术。

近年来，蛋白质组学在食品科学方面的应用逐渐涉及各个方面，包括果实保鲜研究、食品功能研究、食品营养分析、食品品质评价、安全检测及真伪鉴别等。

这为与食品科学相关的研究提供新思路和新技术。

本文概述了蛋白质组学的概念及相关主要研究技术，分析了蛋白质组学在食品科学研究中的应用，尤其水果品质控制方面，并对其在食品加工检测方向的发展前景进行了展望。

关键词：

蛋白质组学；电泳技术；质谱技术；水果；品质控制

Theapplicationprogressofproteomicstechnologyinfruitqualitycontrol

Abstract:

Proteomicsseekstoclarifythegenomeexpressionreallyperformlifeactivitiesproteinexpressionpatternandbiologicalfunctions.Directinterpretationofthephenomenonoflife,accurate,andhasgraduallybecomethesupportofthedevelopmentofmodernbiotechnologytechniques.Inrecentyears,theapplicationofproteomicsinfoodsciencegraduallyinvolveallaspects,includingfreshfruitresearch,functionalfood,foodnutritionanalysis,evaluationoffoodquality,safetytesting,andtheauthenticityofidentification.ThisistoprovidenewideasandnewtechnologyresearchandFoodScience.Thisarticleprovidesanoverviewoftheconceptofproteomicsandrelatedresearch,analysisandapplicationofproteomicsinfoodscience,especiallyfruitqualitycontrolaspectsandprospectsofitsdevelopmentinthedirectionoffoodprocessingdetectionprospect.

Keywords:

proteomics;electrophoresis;massspectrometry;fruit;qualitycontrol

前言

1994年澳大利亚科学家MarcWilkins提出蛋白质组概念，并在1995年7月在《Electrophoresis》生命科学领域从那开始取得了许多突破性的进展。

特别是2003年人类基因组计划完成，功能基因组时代到来，蛋白质组学的研究被提升到新的高度[1]。

全基因组测序工程为世界各物种基因组学的研究奠定了重要的信息基础，也为蛋白质组学的研究提供分析基础。

植物基因组尤其是水果类基因组相对庞大，测序工作进展缓慢。

目前，已测序完成的水果物种有：

番木瓜Caricapapaya（Papaya），西瓜Citrulluslanatus（Thunb.）（Watermelon），甜橙Citrussinensis（Sweetorange），甜瓜Cucumismelo（Melon），黄瓜Cucumissativus（Cucumber），草莓Woodlandstrawberry（Fragariavesca），苹果Malus×domestica（Domesticatedapple），木薯Manihotesculenta（Cassava），香蕉Musaacuminata（Banana），桃Prunuspersica（Peach），番茄Solanumlycopersicum（Tomato），葡萄Vitisvinifera（WineGrape）。

蛋白质组学作为一项较为新兴的技术，以蛋白质组为研究对象，在蛋白质水平上，整体，定量，动态地去研究和分析正在工作的基因组，是后基因组时代的一个重要组成部分[2,3]。

蛋白质组学主要对蛋白质表达进行研究分析，研究工具以分离技术和生物质谱技术为支撑平台，生物信息学为桥梁。

蛋白质赋予食品功能性及营养性等特性，是食品重要组成成分之一。

蛋白质是生物体细胞的重要组成成分，在细胞的结构和功能中发挥重要作用。

为了保证食品蛋白组分的生化活性达到最高期待值，对食品的生产，包括原料养殖（种植）、收获、加工、保藏等环节的控制都需有严格的要求。

因此，在食品生产及最终产品质量控制上，需进行必要的蛋白质检验。

蛋白质组学技术在食品蛋白质研究中应用越来越广泛。

在功能性食品或者高附加值食品的真伪鉴别和品质控制中，蛋白质组学相关技术对蛋白质组分进行分析，获得本质的产品信息。

与传统的检测方法相比优势明显，且为食品功能研究、营养分析、安全监测、品质控制与评价、新型食品开发等研究领域提供新方法。

本文综述了蛋白质组学的主要研究技术及在食品方面的应用进展，重点论述其在水果品质控制与分析，并对其在食品安全监测方面的应用进行展望。

1蛋白质组学

蛋白质组（proteomics）是一个基因组所表达的全部蛋白质[4]，即生物物种、个体、器官、组织、细胞乃至体液等在特定的环境条件、特定的时刻全部蛋白质表达的图谱。

概括来讲，蛋白质组学是基于蛋白质组的对大量蛋白质的整体研究，包括在生长发育中和各种外界因素下的蛋白质结构、功能和丰度的变化等[5]。

同时，蛋白质组学是基因组学与代谢组学之间联系的桥梁，蛋白质组学的研究旨在阐明组织、器官或生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，揭示特定生命现象和过程的机理。

蛋白质组学技术具有的高通量、高精确度等特点，为植物的生长发育、成花机理、胁迫反应、生理处理等内在机理的研究在蛋白质水平上提供了新的研究途径[1]。

蛋白质组学研究的主要技术有：

蛋白质组分分离技术，蛋白质组分鉴别技术及利用蛋白质信息学对蛋白质结构、功能进行分析和预测。

目前蛋白质分离分析技术主要有四种较为常用，分别为：

电泳技术、质谱技术、色谱技术及蛋白质芯片技术。

蛋白质组学的三大核心技术分别是双向电泳技术、质谱技术和生物信息学[6]。

其中，双向电泳技术和质谱相结合的方法是目前较为经典且应用广泛的技术[7]。

2蛋白质组学关键技术

2.1蛋白质样品的提取制备

蛋白质样品的提取及制备技术是蛋白质组学研究的基础和关键。

理想的蛋白质提取方法能够获得大量蛋白、最大程度降低蛋白污染和防止蛋白变性和降解并具有可重复性，有助于获得高质量2-DE图谱和蛋白质相关信息后续研究[8]。

蛋白样品制备是获得高质量且重复性好的2-DE凝胶图像的关键步骤。

蛋白样品的提取的传统常用方法是TCA/丙酮法和酚抽法。

但是，在大量的实验研究中，科学研究人员根据原材料的特殊组成常对着两种方法进行改良以获得最为适合自身研究材料的提取方法。

不管采用哪种方法，在蛋白质样品制备过程中，应尽可能提高样品蛋白溶解度，抽提最大量总蛋白，减少蛋白损失，减少对蛋白的人为修饰，破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

TCA/丙酮沉淀法[9]和酚抽法[10]是植物蛋白质提取的基本且常见的方法。

Isaacson等[11]对上述两种方法做了简要的说明及对比，认为TCA/丙酮法虽已成功运用于植物幼嫩组织蛋白的提取。

但对复杂的顽拗植物组织，如：

成熟葡萄果粒、马铃薯叶片、香蕉果实等，使用酚抽法比TCA/丙酮法获得更好的实验结果。

采用酚抽法可以抑制蛋白酶的活性，避免蛋白质的降解，还可较好地避免酚类、多糖和色素等物质的干扰，得到的蛋白质干粉中杂质少。

Vincent等[12]在进行葡萄果实蛋白质提取时也表明，酚抽提法虽操作复杂、耗时长，但能获得更多的蛋白点和高质量的双向电泳图谱。

Vincent等还发现利用酚抽提法用尿素、硫脲素两种裂解剂再悬浮相结合的方法更适合葡萄蛋白的提取。

同时，Wang等[13]在提取葡萄果实蛋白质组时采用了PVPP/TCA法，即将酚类化合物用酸化的PVPP（增加PVPP聚合能力和消除PVP的污染）多次洗脱后，再用TCA、丙酮沉淀蛋白，此方法耗时少、毒性小且2-DE图谱的质量会随PVPP洗脱次数的增加而提高，同时还适于葡萄果实中β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）的检测与分析。

然而，植物细胞中包含多种次生代谢物质，可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化[14]，从而在果实组织中提取蛋白质难度增加。

由于果实中蛋白质含量相对较低，并且含有大量干扰性物质，如色素、淀粉、多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等，对高纯度蛋白质的提取也有一定的难度[15]。

水果果实蛋白质的提取分离与鉴定研究技术需要进一步探讨与优化。

2.2蛋白质浓度的测定

蛋白质浓度的测定用于衡量蛋白样品的提取量是否满足双向电泳及后续实验的需要。

蛋白质浓度的测定常采用Gornall双缩脲[16]、Lowry酚试剂[17]、Bradford法[18]等比色定量的方法测定,其中Bradford法是应用最广的，很多试剂盒就是在它的基础上优化得来。

Levashov等[19]发现Goa法不仅能够测定全蛋白浓度，还能对较难测定的寡肽、膜蛋白质等的浓度进行测定。

并且Goa方法所获得校准曲线较稳定，灵敏度高，能够适合含量在0.1~1.2mg范围内蛋白质的测定，并且不用繁琐的稀释，较为方便。

另外，Goa法还可检测1g/ml的多肽溶液。

2.3电泳技术

蛋白质组学研究中，主要的电泳技术是双向凝胶电泳（2-DE），其他还有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、毛细吸管电泳（CE）等。

SDS-PAGE曾是蛋白质分析较为常用的方法，此法具有特异性强、操作简单及干扰因素少等优点，可用于检测蛋白质纯度、评估蛋白质分子质量等。

但是这种方法只能将不同分子质量的蛋白分离，对于分子质量相同的蛋白则无法分离[20]。

毛细管电泳（CE）是一种新兴的色谱分离技术，这种技术是将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合[21]。

目前，该技术已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。

与经典电泳相比，毛细血管电泳由于其侧面积/截面积大、能克服由于焦耳热引起的谱带展宽、散热快、可承受高电压，其分离效率较高[22]。

此外毛细血管电泳还具有灵敏度高、样品需求少、速度快、种类多、分离范围广、成本低等诸多优点。

但是其对于复杂样品的分离尚且不完全。

2.3.1双向电泳技术双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）由O′Farrell于1975年创立的，作为蛋白质组研究的核心技术之一，是目前常用的唯一能连续在一块胶上分离某一物种的数千种蛋白质的方法，同时是当前分辨率较高的工具，已在生物学研究方面得到广泛的[23]。

双向电泳根据蛋白质两个相互独立的特性等电点和分子量对蛋白质组分进行两次电泳：

第一向等电聚焦（Isoelectrofocusing,IEF），IEF是基于蛋白质等电点不同而将其分离；第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），是基于蛋白质亚基分子质量不同而分离，从而达到在二维空间上先后将蛋白质分离的目的，并能得到蛋白质等电点和分子量的信息。

两次电泳后会在二维胶上出现浓度不等的点，一个点通常代表一种蛋白质。

电泳之后的染色主要有考马斯亮蓝染色法和银染法、负染、荧光染色法等。

但二维电泳技术对低拷贝、强疏水性、低溶解度、极酸或极碱的蛋白质不易分离，同时也存在繁琐、灵敏度低、不稳定等缺点[24]。

实验过程中，影响双向电泳图谱效果的因素有多方面。

在进行苜蓿、水稻及一些盐生植物[25-27]等的生物学研究中，不同的蛋白提取方法、不同分离胶浓度、不同等电聚焦（IEF）电泳上样量、不同pH范围的固相pH梯度（immobilizedpHgradients,IPG）胶条进行的蛋白质双向电泳图比较，并选取图谱较为满意的双向电泳条件。

另外，实验中双向电泳图谱重复性的优劣关系到实验数据的可比性和平行试验间数据的参考。

保证双向电泳实验良好的重复性也是研究后续差异表达蛋白的基础。

电泳过程中，保证参数和操作一致，如等电聚焦的电压、时间控制，蛋白质转移时胶条的位置、SDS-PAGE的电流电压、染色用水、试剂过滤等操作，从而可保证蛋白质斑点数目、等电点、分子质量以及蛋白质量等在多次不同试验中具有较好的重复性。

水果果实中含大量多糖、色素、酚、醌等次生代谢产物，给蛋白质双向电泳研究增加了难度。

曾有人使用管状载体两性电解质凝胶电泳研究果实蛋白质组学[28]，该实验对研究水果果实蛋白质组有一定的推动作用，但由于方法的局限性较难满足对果实蛋白质组学研究需要。

近年来，应用IPG-IEF与SDS-PAGE系统双向电泳研究水果果实蛋白质组方法逐渐变得普遍并成熟。

2.3.2蛋白质裂解液的选择植物果实中富含的酚类、多糖以及色素等次生代谢物质对蛋白质等电聚焦干扰很大，容易在2-DE凝胶图谱中产生水平条纹。

在双向电泳过程中，为获得较好的等电聚焦效果，蛋白质样品必须完全溶解。

因此，样品裂解缓冲液需达到蛋白样品的最大溶解度。

样品裂解液通常包含离液剂，如尿素和硫脲；表面活性剂，如CHAPS和TritonX-100；还原剂，如DTT、二硫赤藓糖醇（DET）以及磷酸三丁酯（TBP）；也可以选择性的加入Tris-base、蛋白酶抑制剂以及核酸酶等组分[29]。

卢丞文[6]在番茄果实的实验研究中发现，缓冲液中尿素浓度的升高和表面活性剂TritonX-100的加入，对蛋白样品溶解度的增加有促进作用。

2.3.3蛋白质上样量的选择水果果实的蛋白质表达丰度因品种而差别较大，增加或减少蛋白质的上样量会影响样品溶液中盐离子的含量进一步影响等电聚焦效果。

因此，蛋白质样品上样量直接影响双向电泳图谱的效果。

不同水果果实的实验应比较不同蛋白上样量的图谱，选择最为合适的上样量使得双向电泳图谱中蛋白点数目多，各点分离清晰，并能满足双向电泳及后续的质谱分析的需要。

王一鸣等[30]以发育中期的桃果实为试材，探索适用于全细胞蛋白质组分离的双向电泳技术。

为使得双向电泳图谱背景清晰并蛋白点分离效果好，实验采用TCA—丙酮沉降蛋白[11]，所用上样缓冲液含有硫脲和SB3-10效果较好，含有碘乙酰胺的平衡缓冲液其产生背景纹理少、蛋白点清晰，合适的上样量，较窄pH范围的胶条及染色方法最佳选择会使得背景清晰，蛋白点清楚突出。

杨爱珍等[31]为了探究桃果实发育过程后期中、内果皮不同的代谢进程，以“大久保”桃（PrunuspersicaL.cv.Okubao）盛花后56天的果实为试材，TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，采用固相pH梯度（immobilizedpHgradients，IPG）双向电泳系统分离蛋白质，凝胶银染显色后用图像分析软件比较分析差异表达的蛋白点，初步了解中果皮和内果皮蛋白质组表达的差异点。

采用pH5-8IPG胶条进行等电聚焦得到的双向电泳图谱在中果皮与内果皮中检测到蛋白质点的数量分别为（1273±101）和（1292±115）个，所有匹配的蛋白点中有65个在中果皮与内果皮的图谱中均存在，其中30个为内果皮相对于中果皮2倍（P<0.05）上调的点，35个为内果皮相对于中果皮2倍（P<0.05）下调的点。

有10个蛋白点仅在中果皮表达，18个蛋白点只在内果皮表达而中果皮未显示。

表明桃果实发育硬核期中果皮与内果皮的蛋白质组存在一定差异，这些差异初步解释为内果皮主要是进行木质素的沉积，而中果皮主要是进行碳水化合物的代谢过程并为后期糖分的积累和芳香味的形成奠定基础。

2.4色谱技术

在蛋白组学研究技术中，分离纯化技术除电泳技术外，色谱技术（chromatography）又称层析技术也是当前物质分离纯化、分析鉴定的重要方法之一。

目前，蛋白质组学方面常用的色谱技术是高效液相色谱（highperformanceliquidchro-matography，HPLC）。

按照不同的分离模式，其可以分为一维（one-dimensiona，l1D）、二维（two-di-mensiona，l2D）和多维（multidimensiona，lMD）。

因具有分离效率高、检测灵敏度高、分析速度快和应用范围广等特点，高效液相色谱在生产实践中得到了广泛应用。

二维或多维液相色谱，是一种将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。

待分析样品经过第一维的色谱柱进入接口中，通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器。

二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品，即利用样品的不同特性把复杂混合物（如肽）分成单一组分，这些特性包括分子尺寸、亲水性、电荷、特殊分子间作用（亲和）、等电点等。

一维分离系统中不能完全分离的组分，可能会在二维系统中得到更好的分离，分辨率、分离能力得到极大的提高。

多维液相色谱和串联质谱联机可以用来分离鉴定双向凝胶电泳技术容易丢失的低丰度蛋白和膜蛋白[32]。

2.5质谱技术

质谱技术（massspectrometry）是一种鉴定生物大分子的技术。

近年来，质谱技术得到迅速发展，其在蛋白质组研究中主要用于蛋白质的鉴定。

质谱技术的发展是近年来蛋白质组学研究得到迅速发展和应用的关键因素之一[33]。

质谱技术的基本原理是：

样品分子离子化后，根据不同离子的质荷比（m/z）差异对离子进行分离并确定其分子质量。

由于单一地依靠蛋白质相对分子质量并不能对目的蛋白进行理想的鉴定，因此需要事先用蛋白酶（如胰蛋白酶）将检测样品酶解成不同长度的肽段再进行分析。

质谱仪根据离子源的不同，质谱可分为电喷雾离子化质谱（electrosprayionizationmassspec-trometry，ESI-MS）和基质辅助的激光解吸质谱（matrix-assistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry，MALDI-MS），后者常与飞行时间（timeofflight，TOF）质谱联用，称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。

质谱技术中无需将蛋白纯化，可同时鉴定多个蛋白质，具有灵敏度高、易自动化、准确度高的特点，这点是蛋白质组学研究的一个重大突破。

MALDI-TOF-MS与四极杆质谱联合，具有更高的准确度、高分辨率和fmol级的敏感度，可用于鉴定蛋白质修饰从而对阐明蛋白质结构进行说明。

同时将2个质谱连接在一起构成的串联质谱，可以更灵敏、更精确地分析蛋白样品[34,35]。

2.6蛋白质芯片技术

蛋白质芯片技术—SELDI（surface-enhancedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometry，SEL-DI-TOF-MS）作为新发展起来的蛋白质组学主要技术之一，为蛋白质的检测和研究提供了新的技术平台[36]。

蛋白质芯片技术主要应用于差异显示蛋白质组学和蛋白质间相互作用的研究。

蛋白质芯片技术就是将一系列“诱饵”蛋白（如抗体），以阵列的方式固定在经过特殊处理的底板上，然后将其与待分析的样品杂交，只有那些与“诱饵”结合的蛋白才被保留在芯片上。

这种方法实质上是大规模化的酶联免疫吸附测定[37]。

蛋白质芯片技术，全称是表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱，是将蛋白质芯片与飞行质谱相结合，使它既具备芯片的高通量、高效率的特点，又具备飞行质谱的高灵敏度飞级（fg，1×10-15）水平检测的功能[38]。

可用于对血清及组织粗样品中的各种蛋白质直接进行检测，特别适于以往蛋白质分析的盲区，即低分子质量、低丰度和疏水的蛋白质进行研究[39]。

因此，在蛋白质组学的研究中蛋白质芯片技术与目前常规方法比较具有显著的优势。

2.7蛋白质信息学

蛋白质信息学（ProteinBioinformatics）在蛋白质组的分析中起重要作用，一是通过与数据库中的已知蛋白质相比较来判断未知蛋白质的功能；二是预测蛋白质的结构，并判断蛋白质是否发生修饰[40,41]。

蛋白质鉴定的方法主要是利用蛋白质的各种属性参数进行，如：

相对等电点、分子质量、氨基酸组成、序列等信息在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。

如果在数据库中找不到，则有可能是发现了新蛋白，此时可进行新蛋白的鉴定。

近年来，一些处理数据的先进算法和软件相继出现，并且还存在着许多开放性资源和商业化的数据库平台[42]，使得蛋白质的鉴定更快捷、更方便，而且随着基因组学的深入研究，及基因测序工程的范围扩大，从而能为蛋白质组学的研究提供更全面的数据库[43]。

3蛋白质组学在水果品质控制方面的应用

蛋白质组学技术作为一项新兴的科技能力将其应用到食品领域，对食品的成分、营养、生物性能等，或是对食品的品质进行评估并采取有效的控制措施，为食品科学领域的发展注入了新能量。

当前，人们已经将蛋白质组学技术逐渐应用与食品品质分析及控制，功能性研究，真伪鉴别和安全性检测等方面[44-46]。

近年来，蛋白质组学在水果品质控制方面的应用取得了很大的进展。

通常评判果实采收成熟度的依据主要有：

果色、硬度和可溶性固形物等，但这些指标容易受品种、生长条件和季节的影响，因此寻找不受外界环境因素影响的指标用其判断果实的成熟度变得十分必要。

这样也为水果果实的保鲜贮藏提供工具。

在果实成熟衰老的研究中将蛋白质组学与上游的基因组学、转录组学和下游的代谢组学、表型组学相结合，可以更加系统地阐述果实的生理代谢过程[15]。

这样可以为水果果实贮藏保鲜过程中提供有效的检测工具并为选择合适的保藏方法提供合理的方向。

研究发现，在日本李、欧洲李、桃和油桃4种核果类果实的最佳采收期均有4个特异蛋白合成（Z1、Z2、Y和X），它们属于一系列参与防御的抗原物质，可以作为判断桃、李和油桃果实最佳成熟度的一种新方法[46]。

3.1蛋白质组学在水果果实生长发育研究中的应用

果实在发育的过程中，蛋白质含量变化较快，并相较于成熟阶段，发育阶段的果实蛋白含量相对较高。

FaurobertM等[47]在研究番茄发育和成熟过程中的蛋白质组变化中，发现7种蛋白参与果实发育，分别为碳水化合物代谢相关蛋白，氨基酸代谢相关蛋白，蛋白质命运相关蛋白，光合作用、呼吸作用相关蛋白，信号传导相关蛋白，胁迫反应相关蛋白，次生代谢相关蛋白。

果实在发育过程中，高表达的蛋白主要存在于细胞质和叶绿体中，参与光合作用，糖、蛋白质代谢，细胞壁代谢等；在果实成熟过程中，高表达的蛋白主要是与胁迫反应相关的蛋白。

GiribaldiM等[48]研究了内比奥罗葡萄成熟过程中果实蛋白质组的动态变化，从花后1个月到完全成熟，共得到了730个蛋白点，其中118个为差异蛋白点，93种蛋白成功得到鉴定，它们大多数与新陈代谢、能量、蛋白质合成与降解相关。

在转色期前后，与果实表面蜡质和萜类化合物合成相关的柠檬酸裂解酶、乙酰COA转乙酰酶，与氨基酸代谢有关的甲硫氨酸合酶、谷氨酸脱氢酶等大量表达。

在果实成熟过程中，糖酵解能力下降，细胞骨架进行了重新排列