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HPLC色谱柱
HPLC色谱柱的维护与再生及色谱峰异常情况分析与处理方法
引言
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法。
了解一些高效液相色谱的基础知识有助于对化工分析检测工作的认识和理解。
本文简单介绍了高压液相色谱的基本概念和一些经典理论。
一、基本概念和术语
1.1色谱图和峰参数
色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线（elutionprofile）。
基线（baseline）--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
噪音（noise）--基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移（drift）--基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰（peak）--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
不对称色谱峰有两种：
前延峰（leadingpeak）和拖尾峰（tailingpeak）。
前者少见。
拖尾因子（tailingfactor，T），用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子（symmetryfactor）或不对称因子（asymmetryfactor）。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
峰底-基线上峰的起点至终点的距离。
峰高（peakheight，h）-峰的最高点至峰底的距离。
峰宽（peakwidth，W）-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W＝4σ
半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2）-峰高一半处的峰宽。
Wh/2＝2.355σ
标准偏差（standarddeviation，σ）-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
峰面积（peakarea，A）-峰与峰底所包围的面积。
1.2定性参数（保留值）
死时间（deadtime，t0）--不保留组分的保留时间。
即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。
在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积（deadvolume，V0）--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。
它包括4部分：
进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。
其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。
为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。
V0＝F×t0（F为流速）
保留时间（retentiontime，tR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
保留体积（retentionvolume，VR）--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。
又称洗脱体积。
VR＝F×tR
调整保留时间（adjustedretentiontime，t'R）--扣除死时间后的保留时间。
也称折合保留时间（reducedretentiontime）。
在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。
t'R＝tR－t0
调整保留体积（adjustedretentionvolume，V'R）--扣除死体积后的保留体积。
1.3柱效参数
理论塔板数（theoreticalplatenumber，N）--用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。
用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。
（一般HPLC柱的N在1000以上。
）
若用调整保留时间（t'R）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）。
理论塔板高度（theoreticalplateheight，H）--每单位柱长的方差。
实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。
1.4相平衡参数
分配系数（distributioncoefficient，K）--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：
吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。
但一般情况可用分配系数来表示。
在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。
这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。
因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。
混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。
实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。
容量因子（capacityfactor，k）--化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。
因此容量因子也称质量分配系数。
容量因子的物理意义：
表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。
k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。
容量因子与分配系数的不同点是：
K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。
由于t'R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。
选择性因子（selectivityfactor，α）--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。
α又称为相对保留时间（《美国药典》）。
要使两组分得到分离，必须使α≠1。
α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。
从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。
1.5分离参数
分离度（resolution，R）--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。
也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。
分离度计算公式：
R=2（tR2-tR1）/（W1+W2）
当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。
R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。
R≥1.5称为完全分离。
中国药典规定R应大于1.5。
提高分离度有三种途径：
①增加塔板数。
方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。
更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。
②增加选择性。
当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。
一般可以采取以下措施来改变选择性：
a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。
③改变容量因子。
这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。
k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。
但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。
一般k2在1~10范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些。
二、高压液相色谱的塔板理论与速率理论
2.1塔板理论
2.1.1
塔板理论的基本假设
塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。
它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。
塔板理论的基本假设为：
1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。
2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。
3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。
4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。
虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。
但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。
2.1.2
色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）
由色谱流出曲线方程可知：
当t＝tR时，浓度C有极大值。
Cmax就是色谱峰的峰高。
因此：
①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。
②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。
由流出曲线方程对V（0~∞）求积分，即得出色谱峰面积A。
可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。
把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。
2.2速率理论（又称随机模型理论）
2.2.1
液相色谱速率方程
1956年荷兰学者VanDeemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论--速率理论。
它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。
后来Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）。
2.2.2
影响柱效的因素
1）涡流扩散（eddydiffusion）。
由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。
涡流扩散项A＝2λdp，dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。
HPLC常用填料粒度一般为3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。
但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。
大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。
总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。
毛细管无填料，A＝0。
2）分子扩散（moleculardiffusion）。
又称纵向扩散。
由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。
分子扩散项B/u＝2γDm/u。
u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。
在低流速时，它对峰形的影响较大。
Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。
γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。
γ一般在0.6~0.7左右，毛细管柱的γ＝1。
3）传质阻抗（masstransferresistance）。
由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。
溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。
液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。
①流动相传质阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数。
这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。
靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。
②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm为常数。
这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。
Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。
固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。
所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。
Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比。
因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相。
高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。
③固定相传质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。
在分配色谱中Hs与df的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。
因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。
采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。
从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：
①进样时间要短。
②填料粒度要小。
③改善传质过程。
过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。
④适当的流速。
以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。
一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。
⑤较小的检测器死体积。
2.2.3
柱外效应
速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。
色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱内＋σ2柱外＋σ2其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。
为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用"零死体积接头"连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可能小。
研究表明柱外死体积之和应＜VR/。
其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。
此外，要求进样体积≤VR/2。
柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k＜2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著。
由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。
而在经典LC中则影响相对较小。
三、色谱柱的保养维护
3.1高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁
反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。
大多数用于反相色谱的固定相都是天然的疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小来分离的，含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离。
固定相上还有少数物质，如混合相（例如苯基－己基）、末端封闭和非末端封闭种类和极性嵌入相－也存在于这些键合硅胶上。
还有很多填料用于反相色谱，包括聚合物，聚合物表面涂上硅胶和氧化铝，无机－有机混合物，涂层氧化锆，和石墨化碳。
不同种类的固定相有他们自己的优点和缺点。
反相色谱柱利用各种流动相和添加物可以有很多的应用。
一些技术利用添加物可以改变或修饰填料的表面。
有时候这些添加物有可能会污染键合相表面。
硅胶表面因为有着疏水键合相而有一些别的化学性质。
残留的硅烷醇存在于所有的硅胶键合填料中。
这些硅烷醇具有弱酸性，因此能与某些待分析物合基质成分，特别是碱性成分。
因为硅烷醇的pKa值大约是4.5，离子化能在中性pH条件下发生因此与阳离子产生静电相互作用就有可能发生。
较老的A型硅胶能容纳高浓度金属离子（有时候100ppm或更多），而这能使硅胶表面的酸性更大甚至能发生金属鳌合现象或清除一些化合物。
残留硅烷醇在非末端封闭的硅胶合短链键合相如C2或C4上更让人烦恼。
使用者必须清楚他们所用的固定相表面特殊性质和可能的分析物－固定相表面的相互作用，这样当他们使用反相方法时才能考虑到可能的基质相互作用。
例如，非常疏水的样品基质如玉米油，高芳香物质，和蜡能粘住固定相装填表面并且改变他们的性质。
含有蛋白质物质的生物流体也能吸附在装填表面。
尽管分析者想尽最大努力来保护HPLC柱子，某些分析物－基质污染能使固定相受到有害的影响。
当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。
被污染的柱子能产生反压问题。
被污染的反相柱子必须清洗和再生才能恢复原来的操作条件。
这部分的"柱子观察"将讨论可行的方法使柱子回复原来的或差不多原来的状态。
因为键合硅胶柱子是最受欢迎的，我重点讲述这种柱子。
最后，我将讨论别的反相柱子的清洁步骤。
什么导致反相柱子污染产生？
通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东西。
盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与HPLC柱发生相互作用的物质。
这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值。
那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。
这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者是负峰。
如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。
这些行为通常只有通过平行实验才能发现。
有着中等保留值的样品能被缓慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。
有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。
分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。
保留时间会波动，拖尾会出现。
如果足够的污染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，使柱子无法工作以及在堵塞处产生空体积。
3.2清洗硅胶键合柱子
再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。
如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。
有时候，经过多次操作以后的色谱柱用90～100％的溶剂B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积可以清除污染物。
（表2列举了不同规格的HPLC柱子的空体积，因此读者能方便地确定相应柱子冲洗的体积。
）例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。
如果你使用的是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。
应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水）。
冲洗5～10个体积以后才更换强溶剂。
有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。
那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子乐，如果污染物是非生物物质，使用者可以跳过一个或多个另外的有机溶剂去除污染物。
溶剂与溶剂之间的组合有很多。
到柱子厂家的网页上能找到推荐的溶剂系统。
一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。
所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物质如脂质和油类。
我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。
清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。
例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。
但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。
当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。
对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列：
100％甲醇
100％乙晴
75％乙晴－25％异丙醇
100％异丙醇
100％二氯甲烷
100％正己烷
用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。
每种溶剂至少冲洗10个柱体积。
如250mm×4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用1～2ml/min的流速来冲洗，要回复原来的溶剂体系，不需要每一步都冲洗，可以跳过中间步骤。
中间步骤推荐使用异丙醇，然后用没有缓冲的流动相，最后回复起始流动相配置。
四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。
如果使用者怀疑柱子被严重污染，可以二甲基亚砜（DMSO）或者二甲基甲酰铵和水按50：
50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流过色谱柱。
成功再生反相柱子是一个非常耗时间的过程，溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作还有一个问题是清洗过程中是否可以把HPLC柱子反过来。
因为大多数强保留的污染物都会累积在柱头，把柱子反过来可以缩短污染物被冲出柱子的移动距离。
考虑到装填柱子的稳定性，现在大多数HPLC柱子都是比普通操作压力大很多的高压装填的，因此他们的柱床应该不会受到反方向流速的影响。
但是，如果头上的烧结比尾部的烧结孔径大的话。
例如尾部烧结的孔径是2μm，他通常能够留住平均5μm孔径里的填料。
有时侯厂家会让头部孔径较大以避免样品或流动相颗粒堵塞。
如果这种孔径大于装填颗粒尺寸分布曲线的最小粒径时，有些填料能穿过这些缝隙而流出色谱柱，这样会导致空白出现。
如果柱子有箭头标志建议的流动方向，我建议通过操作手册和说明书，厂家主页或者技术支持部门等确认是否可以把柱子反过来冲。
无论你是否把柱子反方向，最好不要让溶剂通过检测器避免污染物和穿透缝隙的颗粒进入检测池，否则有可能引起污染。
清洗柱子频率主要看有多少强保留物质被打入色谱柱。
因为反相柱有时候在分辨率消失或者鬼峰出现前能承受很大的污染，使用者经常会等到出现了异常情况才开始注意。
然而，污染物过多的累积会导致清洗柱子的难度加大。
所以，如果你知道经常用杂质较多的样品上样时，我建议你们有规律地清洗柱子，你越是频繁清洗柱子，就清洗起来就越不费劲。
3.3清洗硅胶键合反相柱的蛋白质残余
如果是生物物质如血浆或血清等积累在反相色谱柱上，操作者必须采用不同的清洗程序。
大部分情况下，纯有机溶剂如乙晴或甲醇不溶解多肽和蛋白质因此不能有效地清洗柱子。
然而，有机溶剂和缓冲液、酸、离子对试剂等的混合物则能有效地溶解。
一开始，先开始尝试用百分比含量高的高强度溶剂（溶剂B）冲洗一体积。
Freiser和他的合作者发现重复变化三氟乙酸水溶液和三氟乙酸－丙醇之间梯度的高低可以再生被污染的反相柱子。
Bhadwaj和Day认为在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇就能起到效果。
如果上述几个方法都不成功，Cunico和他的同事推荐了几种强溶剂和增溶剂来除去蛋白质（见表三）。
在使用这些溶剂之前，可以先咨询柱子的厂商确保这些溶剂能与柱子的填料相容。
硅胶基质的柱子通常来说都是相容的，但有机聚合物基质的柱子可能会在某些溶剂组合中膨胀或收缩，这样会影响其色谱行为。
当用前述的溶剂系列时，确保表三所提到的溶剂能与系列中的溶剂互混。
对每个溶剂系统至少要冲洗20体积。
由于有些溶剂系统黏性很大，冲洗的流速应该相应调整以确保不会超过泵压。
用完胍或尿等溶剂侯，至少应该用40～50体积的HPLC级水来冲洗柱子。
对于反相柱子，不建议用表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）和三硝基甲苯，因为这些化合物必然会牢固吸附在硅胶键合相柱子上很难除去。
用表面活性剂会影响装填表面而改变其性质。
然而有一个分离小组的研究表明由某个小组做的污染后的柱子可以用500μL1％SDS溶液用1ml/min的流速清除下多肽合成产物。
如果继续用从5％～95％含1％（v/v）三氟乙酸的乙晴梯度洗脱，可以恢复多肽的分离。
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