测定α淀粉酶活力的方法.docx

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测定测定淀粉酶活力的方法淀粉酶活力的方法测定-淀粉酶活力的方法LT本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。

三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响

（一）试剂及材料1、1：

30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1：

30倍蒸馏水稀释。

2、0.2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至100mL。

3、1%NaCl溶液称取1.0g氯化钠，加水溶解稀释至100mL。

4、1%CuSO4溶液称取1.0g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。

5、标准稀碘液称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。

吸取2mL上述碘液，加入10g碘化钾，用水稀释至500mL。

（二）仪器设备电热恒温水浴锅。

（三）操作方法取试管3根，编号后按下表配置实验样液。

试管序号0.2%可溶性淀粉1%NaCl1%CuSO4蒸馏水混匀，放入37水浴中保温10min。

立即加入唾液淀粉酶。

1：

30唾液淀粉酶12.0mL1.0mL/1.0mL22.0mL/1.0mL/1.0mL32.0mL/1.0mL1.0mL用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。

四、温度与PH值对-液化淀粉酶活力的影响

（一）试剂与材料1、2%可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉2.0g（预先在105烘干），预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。

2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液

（1）0.2mol/mLNa2HPO4称取35.60gNa2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。

（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。

3、供试酶液的制备称取固体-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液100mL（缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成），于40恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm/min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。

4、标准比色液甲液：

称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748g，溶解并定容至500mL。

乙液：

称取铬黑T40.00mg，溶解并定容至100mL。

使用时取甲液40.0mL、乙液5.0mL，混合。

混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新配置。

5、标准稀碘液。

（二）仪器设备电热恒温水浴锅。

（三）操作方法1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。

2、不同温度对-液化淀粉酶活力的影响取4根25200mm试管，按下表配制反应溶液。

试管序号12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0缓冲液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根试管分别放入50、60、70、80恒温水浴中预热10min分别加供试酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL反应完成时间记录（min）50607080加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。

3、不同PH值对-液化淀粉酶活力的影响取5根25200mm试管，按下表配制反应溶液。

试管序号2%可溶性淀粉缓冲溶液恒温水浴60预热10min。

供试酶液反应完成时间记录（min）120mLPH4.05.0mL0.5mL320mLPH6.05.0mL0.5mL420mLPH7.05.0mL0.5mL520mLPH8.05.0mL0.5mL其它操作与温度对酶活力影响实验相同。

五、结果计算和讨论淀粉酶活力单位定义为在一定条件下，1g酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数。

酶活力单位（U/g）=式中：

20可溶性淀粉的用量（mL）；t酶解反应完成所需的时间（min）；0.5测定时稀释酶液用量（mL）；0.02可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）；n酶制剂稀释倍数1、不同温度对-液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果50607080酶活力（U/g）2、不同pH值对-液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0酶活力（U/g）分别以PH值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制PH值酶活力单位、温度酶活力单位图。

讨论分析实验结果。

六、思考题1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？

2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？

3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？

为什么？

4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？

5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？