实验七 流式细胞仪检测技术.docx
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实验七流式细胞仪检测技术
实验七流式细胞仪检测技术
免疫细胞是一组不均一的细胞群体。
各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。
随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。
本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理
流式细胞仪（flowcytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescenceactivatedcellsorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。
当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
根据测得的散射光（scatteredlight）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度（fluorescenceemissions）则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。
含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。
带正电荷的微滴被吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。
以这种方式，特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。
实验应用
流式细胞仪主要有两个最基本的用途：
第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。
1.免疫细胞群的分类静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。
然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。
例如,B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。
T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。
因此，可由这些特征性的表面标志，将细胞分为不同的群或亚群。
2.免疫细胞的分化发育免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地发生着变化。
如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的过程。
正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。
通过检测这些标志，即可判定某些因素（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。
3.免疫细胞的分子表达免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。
通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。
例如，静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。
因此，可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。
4.免疫细胞的分离如前所述，免疫细胞是一组极不均一的群体。
所以在研究免疫细胞功能时，常常需要把某些特异的细胞分离和纯化。
虽然免疫细胞分离的方法很多，但用FACS来纯化特定的细胞群是目前最为有效和方便的手段。
例如，最近颇受关注的CD4+CD25+T淋巴细胞是一群具有免疫调节（免疫抑制）功能的细胞群。
在对其特点及功能进行研究时，首要的问题是分离该细胞群。
用相应的单克隆抗体与其结合，再用FACS进行分离，就能得到纯度很高CD4+CD25+T淋巴细胞细胞群。
而其他分离方法不仅分离过程烦琐，也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。
实验方法
流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。
第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。
（一）细胞和试剂的准备
材料
（1）细胞样品：
来源淋巴细胞或外周血的白细胞。
（2）荧光标记单克隆抗体：
常用的有FITC（fluorescein-isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。
（3）封闭抗体：
抗Fc受体抗体
免疫细胞表面一般表达有Fc受体，能和抗体的Fc段结合。
封闭抗体的作用就是阻断荧光标记的单克隆抗体的Fc段与免疫细胞表面Fc受体结合所产生的非特异性的结果。
（1）FACS缓冲液：
1×PBS950ml
FCS40ml
10%叠氮钠溶液10ml
（2）仪器缓冲液（FACS-flow）：
仪器厂家提供
（3）FACS清洁液（FACSclean）和FACS洗净液（FACSrinse）：
仪器厂家提供。
操作步骤
（1）单细胞悬液的制备：
将1×105~1×107的细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100μl悬浮细胞。
（2）封闭细胞表面Fc受体：
在步骤1中加入Fc受体抗体0.5μl（0.5mg/ml），水浴3分钟。
（3）细胞与荧光抗体结合：
在步骤2中加入荧光抗体1μl（0.5mg/ml），水浴30分钟。
（4）洗细胞去除游离的荧光抗体：
在步骤3中加入FACS缓冲液350μl，轻轻混匀，3000r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。
（5）上样前处理：
取100μl仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。
（二）仪器的操作
以FACSCaliburTM（BDBiosciences）仪器为例。
仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuestsoftwere）。
仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。
1.使用前的准备
（1）打开电源：
包括系统电源和主机部分电源。
（2）检查供液槽和废液槽：
供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。
（3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。
（4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。
2.使用中的操作
（1）计算机部分——使用CELLQuest程序系统软件：
设定所要检测细胞的数量：
一般设10000~20000个细胞。
命名本次实验：
一般含使用者的姓名和实验日期。
打开记数部分：
显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。
将微机与主机连接：
控制检测时的预检测和实际检测。
主机设定：
一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压。
探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。
选择检测的波长和表达方式（plot）：
如果用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）（表11-1）：
如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dotplot）或轮廓线图（contourplot）表
CD69分子表达检测直方图的数值说明
a.anti-CD3（-）检测结果
marker
Left,right
events
%gated
%total
mean
Geo,mean
CV
median
PeakCh
All
1,9910
10000
100.00
100.00
12.06
4.59
1453.37
3.22
1
M1
1,105
9969
99.69
99.69
8.04
4.53
134.41
3.22
1
M2
105,9910
31
0.31
0.31
1304.57
309.78
223.13
164.00
112
b.abti-CD3（2ng/ml）检测结果
marker
Left,right
events
%gated
%total
mean
Geo,mean
CV
median
PeakCh
All
1,9910
10000
100.00
100.00
200.53
48.90
193.68
61.53
1
M1
1,100
5776
57.76
57.76
24.41
11.69
109.22
12.86
1
M2
100,9910
4237
42.37
42.37
440.31
344.57
114.76
361.90
417
c.abti-CD3（10ng/ml）检测结果
marker
Left,right
events
%gated
%total
mean
Geo,mean
CV
median
PeakCh
All
1,9910
10000
100.00
100.00
236.90
74.05
155.88
113.42
495
M1
1,90
4602
46.02
46.02
25.13
12.83
101.67
14.42
1
M2
90,9910
5425
54.25
54.25
415.81
327.83
102.28
349.12
495
CD4及CD8细胞点状二维图结果
quad
events
%gated
%total
Xmean
Xgeo.mean
Ymean
Ygeo.mean
UL
1614
16.14
16.14
3.68
2.99
346.86
291.03
UR
7425
74.25
74.25
99.38
76.39
308.36
256.26
LL
558
5.58
5.58
4.00
3.39
9.91
6.88
LR
403
4.03
4.03
123.32
93.65
7.14
4.35
不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表
用于FACS的荧光物
荧光物
激发波长（nm）
FITC
525（green）
PE
575（orabge-red）
RED613
610（red）
PI
620（red）
PerCP
650（red）
TRI-COLOR
650（red）
CyChrome
670（red）
（2）细胞的吸入：
将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。
先预检测样品，然后进行实际检测。
可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。
所有的数据将自动存入微机。
3.使用后的清洗所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。
（1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。
（2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。
（3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。
（4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。
（5）最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器。
（6）将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。
应用举例
（一）小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子表达的检测
a.简要说明
（1）细胞为小鼠胸腺细胞。
（2）抗体为PE标记的抗CD4抗体和FITC标记的抗CD8抗体。
b.结果以点状二维图（dotplot）表示，见表11-2。
横坐标为CD8分子，纵坐标为CD4分子。
所以右上代表双阳性细胞群，左下代表双阴性细胞群，左上代表CD4+CD8-的单阳性细胞群，右下代表CD4-CD8+单阳性细胞群。
c.结果分析胸腺中存在着发育不同阶段的胸腺细胞，这些发育不同阶段的胸腺细胞表达CD4及CD8分子存在着差异。
上面的结果是正常小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子的表达情况：
①存在着4种亚群：
CD4-CD8-的双阴性细胞群（5.6%），CD4+CD8+的双阳性细胞群（74.3%），CD4+CD8-的单阳性细胞群（16.1%）和CD4-CD8+的单阳性细胞群（4.0%）；②在这4种亚群中以CD4+CD8+的双阳性细胞群为主（75%）。
（二）小鼠脾细胞中T细胞和B细胞的组成
1.简要说明
（1）细胞为小鼠脾细胞
（2）抗体为PE标记的抗CD3抗体和FITC标记的抗CD45R抗体
2.结果以点状二维图表示，见表11-4。
横坐标为B220分子，纵坐标为CD3分子。
因此，左上为T细胞群，右下为B细胞群。
3.结果分析在脾脏中主要存在有两大类淋巴细胞群——T细胞和B细胞。
其中B细胞占60%左右，T细胞占30%。
B220及CD3细胞点状二维图结果
quad
events
%gated
%total
Xmean
Xgeo.mean
Ymean
Ygeo.mean
UL
3067
30.67
30.67
2.36
2.08
87.39
50.96
UR
371
3.71
3.71
183.95
86.41
1888.23
141.27
LL
619
6.19
6.19
3.77
3.23
3.82
3.07
LR
5943
59.43
59.43
215.54
186.49
1.91
1.60
（三）活化T细胞CD69分子的表达
1.简要说明
（1）成熟T细胞来自正常小鼠脾脏，经纯化而获得，通常情况下T细胞处于静止状态，而在不同浓度的抗CD3抗体的刺激下T细胞活化。
（2）抗体为FITC标记的抗CD69抗体。
2.结果以直方图表示，参见表11-1。
横坐标为荧光的强度，纵坐标为具有相应荧光强度的细胞数。
3.结果分析在没有抗CD3抗体刺激时，绝大多数处于静止状态的T细胞不表达CD69分子（CD69+0.3%）；在2μg/ml抗CD3抗体刺激下，42.4%的T细胞表达CD69分子；在10μg/ml抗CD3抗体刺激下，54.3%的T细胞表达CD69分子。
说明静止的T细胞不表达或表达较少的CD69分子，而活化的T细胞则表达高水平的CD69分子，并且该分子的表达随着活化的强度而增加。
因此，检测CD69分子可作为T细胞活化的标志。
关键点
（1）减少非特异荧光染色
细胞的活性和状态：
流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。
因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。
否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。
封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。
细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。
（2）单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。
（3）如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。
实验八杀伤细胞功能的检测
杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，免疫系统中有多种具有杀伤功能的靶细胞，如自然杀伤细胞（NK）、细胞毒性T细胞（CTL）、具有ADCC作用的单核细胞巨噬细胞等。
在体外，多种细胞因子（如IL-2）可明显促进某些效应细胞的杀伤功能（如LAK），此外，通过识别靶细胞某些膜分子的抗体可介导重导向杀伤功能。
本章主要介绍NK、LAK和重导向杀伤试验。
由于混合淋巴细胞培养（MLC）可诱导出NK、CTL和LAK靶细胞，因此在本章一并介绍。
一.自然杀伤细胞（NK）和淋巴因子激活杀伤功能（LAK）的检测
原理
NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中，能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞，无需抗原或有丝分裂原刺激，也不依赖抗体或补体，在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。
LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。
通过将同位素51Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞Libr（黑色素瘤细胞），按一定细胞比例与效应细胞（NK或LAK）孵育4小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的51Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。
试剂和器材
1.细胞系：
K562、LiBr
2.10%FCSRPMI1640
3．rHuIL-2
4.3H-TdR、51Cr
5．培养瓶、培养板、CO2孵箱、离心机
6．β-液闪仪、γ-计数仪
操作步骤
1．效应细胞的制备
NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。
LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腺水）中分离的淋巴细胞（1106/ml）在含有高剂量IL-2（200~1000ul/ml）的10%FCSRPMI1640诱导2~5d而成。
2．杀伤试验
主要有51Cr4h释放法和3H-TdR释放法，前者操作时间短，非常敏感；后者需要无菌操作，所需时间较长。
（1）51Cr4h释放试验：
①收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×106/ml
②取1×106细胞（0.5ml），加Na251CrO4100uCi,37度孵育2~3h，每15min轻轻振摇一次。
③用10%FCSRPMI1640洗涤3次，每次800rpm、5min。
④重悬细胞浓度1×105/ml。
⑤96孔v型或U型培养板中，每孔加100ul（1×104细胞），设3个复孔。
⑥每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100ul1%TritonX-100；自然释放组加100ul完全培养基。
⑦200g离心1min。
⑧37度、CO2孵箱培养4h。
⑨200g离心1min。
⑩每孔取出100ul上清，β计数仪测定值。
计算：
特异性杀伤率（%）=（实验组cpm-自然释放cpm）/（对照组-自然释放cpm）
（2）3H-TdR释放试验
①收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×106/ml，加3H-TdR20uCi。
②7度孵育2~3h。
③用10%FCSRPMI1640洗涤3次，每次800rpm、5min，调整浓度为1×105/ml。
④96孔U型或平底培养板中，每孔加100ul（1×104细胞），设3个复孔。
⑤每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100ul1%TritonX-100；自然释放组加100ul完全培养基。
⑥CO2孵箱培养18~24h。
⑦每孔取出100ul上清，加入胰蛋白酶（终浓度0.15%）和DNA酶（终浓度为0.0125%）
⑧继续孵育30min。
⑨用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。
⑩烤干后，β计数仪测定值。
计算：
特异性杀伤率（%）=（1-实验组cpm/对照组cpm）×100%
（二）注意事项
1．每次试验最好取3~4个不同的效应细胞/靶细胞比例，常用效靶比例为100：
1、50：
1、25：
1、12.5：
1。
2．诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。
3．避免同位素污染。
根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，常用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞（见表）。
用Percoll不连续密度梯度离心纯化人NK细胞
加样细胞
梯度顺序
1
2
3
4
5
Percoll浓度（%）
40.0
42.5
45.0
47.5
50.0
细胞回收率（%）
100
1.6
3.5
8.5
28.5
21.5
LGL（%）
12
5
82
74
7
2
LU/107细胞
42
16
192
143
4
1
1个溶解单位（Lyticunit,LU）为一定效应细胞30%溶解（杀伤）5×103/靶细胞（K562）的水平。
如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。
具体方法是将Percoll分离的位于第2、3梯度间的细胞洗涤后，调整细胞浓度为5×106/ml，移入试管，加入2mlFCS和2ml1×108/mlSRBC，100g离心5min，29度孵育1h，轻轻重悬细胞，叠加于3mlFicoll上，400ug室温下离心30min，界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可大于90%。
在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用NH4Cl方法，因为后者可降低NK功能。
在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄。
不同小鼠系NK活性的差别
NK高水平系
CBA/J
C3H/J
C57BL/6
C57BL/10
DBA2
NK低水平系
A/Sn
A/J
AKR
SJL
BALB/c
三周内或3月龄以上小鼠的NK水平一般很低。
二、混合淋巴细胞培养
混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）以往为用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。
由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此MLC又是免疫调节研究中常用的实验模型。
原理
两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此外双向混合淋巴细胞培养（twowayMLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂酶C处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（onewayMLC）。
两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。
EB病毒转化的B淋巴细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。
试剂器材
1．细胞：
刺激细胞N23细胞系，反应细胞：
外周血单个核细胞。
2．10%FCSRPMI1640培养基。
3．照射源：
60Co装置
4．细胞培养瓶、培养板、滴管、吸管等。
5．CO2孵箱、超净台。
操作步骤
1．刺激细胞的准备：
常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴细胞（如N23细胞）或PBMC。
取处于对数生长期的N23细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中，调整细胞数为1×106/ml~2×106/ml，移置于塑料培养瓶或者50ml离心管中，用60Co照射3000rad。
2．反应细胞的准备：
分离纯化待检个体的
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