马钱子生物碱贴剂的定位镇痛与药动学机制讨论.docx

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马钱子生物碱贴剂的定位镇痛与药动学机制讨论

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　　人们早期认为，药物通过角质层、活性表皮到达真皮层，血管系统迅速地吸收进入血液循环系统。

随后研究发现：

皮肤局部应用吡罗昔康时，药物蓄积在用药部位皮下深层组织，局部血管在深层的组织传递发挥了关键的作用。

药物溶液直接用于大鼠腹部去除角质层的皮肤，药物传递到深层组织早期主要由直接渗透，血液循环分布则随时间延长而增加。

然而，药物皮肤局部应用是由血液循环系统分布到关节液，还是直接渗透到关节液，近年仍有争议。

外用制剂用于治疗用药部位皮下深层组织的疗效取决于药物多大程度直接从用药部位的皮肤传递到靶组织。

本研究采用体外透皮方法考察马钱子生物碱贴剂中士的宁与马钱子碱的透皮速率，研制了一种含马钱子生物碱的黏胶分散型贴剂。

优选的马钱子生物碱贴剂用于小鼠腹部以评估其药动学与药效学的作用机制。

　　1材料与方法

　　材料与动物

　　马钱子碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号100583‐200401，含量为%）;士的宁对照品（中国药品生物制品检定所，批号110705‐200306，含量为%）;吗氯贝胺对照品（中国药品生物制品检定所，批号110706‐200505，含量为%）;甲醇（色谱纯，Merck，Germany）;甲酸（色谱纯，ROEscientificinc.，USA，LOT0J0921）;水为自制重蒸水，其它试剂均为国产分析纯（AR级）。

马钱子购自湖南五洲通药业有限公司，经湖南zho鉴定为马钱子科马钱子种子。

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18‐22g，清洁级，由上海斯莱克动物研究中心提供，生产许可证号：

SCXK（湘）2009‐0004。

于湘潭大学药学教研室动物实验中心饲养，室温22±2℃，相对湿度50%～60%，昼夜节律光照。

　　马钱子生物碱贴剂处方的优化

　　马钱子生物碱贴剂的制备

　　马钱子生物碱参照文献方法制备，高效液相色谱法测定提取物中士的宁和马钱子碱的含量。

马钱子生物碱制成适宜浓度的氯仿溶液。

药液与通透促进剂加入到丙烯酸酯压敏胶，机械搅拌1小时混合均匀。

将混合物涂布在聚酯类防粘材料的表面（ScotchPak1022,3M,美国），静置20分钟，再于70℃烘烤15分钟。

放冷后，含药压敏胶涂层贴于聚酯类背衬材料（ScotchPak9726,3M,美国），用塑料膜包好后放入干燥器备用。

贴片的表面应光滑、均匀而富有弹性。

贴片的厚度由整个贴片厚度减去背衬材料与防粘材料的厚度计算，用千分尺测量,厚度为100±10μm。

马钱子生物碱贴剂用乙酸乙酯加热回流提取小时，加入甲醇稀释至适当的浓度，高效液相色谱法测定士的宁和马钱子碱的浓度，计算马钱子生物碱贴剂中士的宁和马钱子碱的含量。

　　体外透皮实验研究

　　家猪杀死后，立即割下耳朵，用自来水清洗干净，吹干，电剪小心剃去耳朵脸外侧的毛发。

用Z10100植皮刀（上海，中国）取厚约600μm的皮肤。

仔细检查皮肤，将无破损的皮肤切成约2cm×2cm的块状，皮肤用保鲜膜包好并‐20℃保存，储存时间不超过两星期。

皮肤解冻后，受试贴剂贴于皮肤角质层并朝向扩散池，置扩散池与接收池之间，铁夹夹紧。

接受池加满接受液（磷酸缓冲液）并排尽气泡。

磁力搅拌速度300r/min，温度37℃。

透皮开始后按规定时间点取样，取样后立即补充新鲜的接收液，高效液相色谱法检测接受液中药物的浓度。

累积透皮量（Q,μ‐2）的按下列公式计算：

Q=（VCn+Σi=1n‐1ViCi）/A。

Cn为第n个取样点浓度（μ‐1）;Ci为第i个取样点浓度（μ‐1）;V为接受液体积（ml）;Vi第i个点取样体积（ml）;A为药物经皮吸收面积（cm2）。

经皮速率常数J（μ‐‐1）的计算：

以Q值为纵坐标，时间t为横坐标（h），进行线性回归，y=ax+b，a即为经皮速率常数。

透皮速率常数、微透析探针校正与药物浓度以均数±标准差表示。

　　马钱子生物碱贴剂的镇痛实验

　　昆明种小鼠，随机分为空白对照组、胸部给药组与腹部给药组，每组十只，雌雄各半。

1cm2马钱子生物碱贴剂分别贴于小鼠胸部与腹部，空白对照组则用不含药基质制备的贴剂。

贴小时，小鼠按/10g注射1%醋酸（v/v）。

记录注射醋酸小鼠开始扭体的时间与15分钟扭体的次数，数据以均数±标准差表示。

　　马钱子生物碱贴剂小鼠腹部给药的药动学

　　实验前一天电推剪小心剃去小鼠腹部的毛发。

1cm2马钱子生物碱贴剂贴于小鼠腹部，给药后、、、、、小时摘取眼球取血。

每组六只小鼠，血液加入肝素的离心管，离心后取血浆冷冻保存。

取血后立即处死小鼠，用乙酸乙酯将皮肤表面残留的药物清洗干净。

仔细分离给药部位表皮与腹膜，精密称重。

电推剪小心剃去小鼠腹部的毛发，剪开小口，微透析探针从开口处埋入腹腔，2μl/min灌流林格氏液平衡小时。

埋入探针的腹膜之上贴1cm2马钱子生物碱贴剂。

给药后每隔小时收集微透析样品，第小时揭去贴剂。

2μl/min灌流林含药格氏液平衡小时，再次每隔小时收集三份微透析样品。

　　样品检测

　　采用高效液相色谱法测定体外透皮样品中士的宁与马钱子碱的含量。

LC‐20AT液相泵（岛津，日本）;PDA‐20A检测器（岛津，日本）;LCSolution工作软件（岛津，日本）;SIL‐20A自动进样器（岛津，日本）;CTO‐10ASCP柱温箱（岛津，日本）。

色谱柱：

IntersustainC18柱（×250mm,5μm，岛津，日本）;流动相：

%三乙胺溶液（含1%的甲酸）—甲醇=73:

27（v/v）;流速：

/min;柱温：

40℃;进样量：

50μl。

肌肉透析液中士的宁与马钱子碱的浓度采用UPLC‐MS法测定。

血浆、皮肤与肌肉匀浆液中士的宁与马钱子碱浓度则采用UPLC‐MS/MS法测定。

ACQUITYUPLCTM超高效液相色谱仪，QuattroPremier质谱检测器，色谱工作站（Waters公司，美国）。

色谱柱：

ACQUITYUPLC™BEHC18（×50mm，，沃特斯，美国）;流动相：

20mmol∙L‐1醋酸铵溶液（含%的甲酸，pH值=）—甲醇（:

，v/v）;流速：

ml/min;柱温：

40℃。

　　2结果

　　马钱子生物碱贴剂处方的优化

　　采用体外透皮实验，以士的宁与马钱子碱的稳态透皮速率优化马钱子生物碱贴剂的制剂处方。

压敏胶中药物含量固定在%士的宁与%马钱子碱（m/m，以干燥压敏胶质量计）。

如表1所示，士的宁透皮速率压敏胶DT87‐4098比DT87‐2677与DT87‐2852分别高倍与倍;马钱子碱透皮速率压敏胶DT87‐4098则比DT87‐2677与DT87‐2852分别高倍与倍。

因此，选择压敏胶DT87‐4098进一步优选不同的透皮促进剂。

含油酸贴剂的士的宁和马钱子碱的透皮速率约提高倍;含柠檬烯贴剂的士的宁和马钱子碱的透皮速率分别提高倍与倍。

　　马钱子生物碱贴剂的镇痛实验

　　1cm2马钱子生物碱贴剂分别贴于小鼠胸部与腹部，对照组贴敷1cm2不含药的空白压敏胶基质。

胸部组用药小鼠（±）与空白组对照组（±）扭体次数相近，腹部组小鼠扭体次数（±）显著低于空白组与胸部组，如图3所示。

与对照组与胸部给药组比较，小鼠扭体抑制率分别为%与%。

　　马钱子生物碱贴剂的药动学研究

　　皮肤应用马钱子生物碱贴剂后皮肤、肌肉与血浆中士的宁与马钱子碱的浓度如图4所示。

皮肤与肌肉的药物浓度逐步升高，4小时达到平衡。

皮肤与肌肉中士的宁AUC0-8h值分别为±μg·h/g,±μg·h/g与±·h/mL;皮肤与肌肉中马钱子碱AUC0-8h值分别为±μg·h/g,±μg·h/g与±·h/mL。

皮肤与肌肉中士的宁与马钱子碱浓度通常高于10μg/g，而血液中士的宁与马钱子碱浓度通常不到10ng/g。

士的宁与马钱子碱的小鼠腹腔探针平均回收率分别为%±%与%±%。

如图5所示，马钱子生物碱贴剂腹部给药后小鼠腹腔液中非蛋白结合的药物浓度保持稳定，士的宁与马钱子碱的宁AUC0-8h分别为±·h/mL与±·h/mL。

　　3.讨论

　　马钱子生物碱贴剂的制剂处方优化

　　压敏胶是制备皮肤贴剂的关键成分。

丙烯酸酯压敏胶有以下优点：

良好的生物相容性、优异的黏贴性能及与药物和多种辅料的化学相容性。

由于丙烯酸酯压敏胶的功能基团赋予压敏胶基质不同的理化性能，它们也能导致贴剂中药物的透皮速率显著地改变。

本研究马钱子生物碱贴剂中士的宁与马钱子碱的体外透皮速率从不含功能基团的87‐4098显著高于含羧基的87‐2852与87‐2677。

此现象主要是药物的氮原子与压敏胶所含的羧基之间相互作用产生。

皮肤角质层形成药物透皮吸收的屏障，克服皮肤屏障有效的方法是使用透皮促进剂。

本研究前期以乙醇为载体溶剂，考察各种透皮促进剂对士的宁与马钱子碱透皮吸收的影响，同时对两种生物碱产生最强的促透作用为柠檬烯，其次是油酸。

为提高贴剂的药物透皮吸收速率，通常在贴剂压敏胶中加入透皮促进剂。

但在87‐4098丙烯酸酯压敏胶制备的马钱子生物碱贴剂时分别加入柠檬烯与油酸，对士的宁和马钱子碱的促透作用油酸反倒比柠檬烯强。

这可能是由于透皮促进剂与压敏胶之间可能存在某种复杂的相互作用。

　　马钱子生物碱贴剂定位镇痛的机制探讨

　　小鼠醋酸扭体法是一种炎症性疼痛的动物模型，镇痛药与抗炎药均可抑制小鼠醋酸扭体反应。

醋酸刺激小鼠的注射部位而引起局部的炎症，炎症组织释放前列腺素、肿瘤坏死因子α、白介素‐1与白介素‐8等炎症介质从而引起小鼠伤害性的疼痛反应。

文献报道马钱子生物碱同时具有镇痛效应与抗炎的活性。

马钱子生物碱贴剂是经皮肤吸收进入血液发挥镇痛作用，还是通过皮肤直接传递到局部的炎症组织发挥抗炎作用?

本研究发现小鼠腹部应用马钱子生物碱贴剂能显著地减少醋酸扭体次数，而小鼠胸部组却与对照组相近。

随后进一步研究结果表明活性成分显著地蓄积于小鼠用药部位的皮肤与深层肌肉，但血药浓度不会明显升高。

这些研究结果表明马钱子生物碱贴剂用药后，活性成分主要通过用药部位皮肤直接传递到下邻的炎症组织发挥疗效。

绝大多数的药理效应发生在组织，故大多数药在特定的靶组织发挥疗效。

严格地来说，只有靶组织细胞外液中非蛋白结合药物浓度直接与疗效相。

因此，马钱子生物碱贴剂局部应用后腹腔液中非蛋白结合活性成分浓度与直接抗炎镇痛的疗效相关。

微透析是一种能监测靶组织细胞外液药物浓度的取样技术。

本实验利用微透析技术监测腹腔液中非蛋白结合的士的宁与马钱子碱浓度，实验发现马钱子生物碱贴剂局部应用后腹腔液中药物浓度长时间维持稳定。

其合理的解释是腹膜中高浓度的药物能被动地扩散到腹腔液中，同时到达腹腔液的药物能被内脏与腹膜的带走血流，药物分布到腹腔液的速率与腹腔液中药被血流带走的速率相等。

靶组织非蛋白结合的药物浓度稳定也意味着马钱子生物碱贴剂局部应用能持续地发挥疗效。

　　4结论

　　马钱子生物碱贴剂的优选处方以87‐4098为压敏胶，含5%油酸、士的宁%与马钱子碱%。

1cm2马钱子生物碱贴剂用于小鼠腹部，由醋酸引起的扭体反应次数显著下降;活性成分主要蓄积于用药部位皮下深层组织而不会明显升高血药浓度;用药期间腹腔液中非蛋白结合的士的宁与马钱子碱浓度维持稳定。

上述研究结果意味着马钱子生物碱贴剂通过定位传递对用药部位皮下深层组织能持续地产生疗效。

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