样品的采集和处理重庆疾病预防控制中心.docx

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样品的采集和处理重庆疾病预防控制中心

全国艾滋病检测技术规范

NationalGuidelineforDetectionofHIV/AIDS

（2015年修订版）

中国疾病预防控制中心

二○一五年十二月

全国艾滋病检测技术规范

NationalGuidelineforDetectionofHIV/AIDS

（2015年修订版）

中国疾病预防控制中心

二○一五年十二月

前言

艾滋病在我国的流行已数十年，随着感染者和临床病人的不断增加、感染人群的变化，艾滋病检测工作量逐渐加大，对监测和检测的需求也不断增加，承担艾滋病检测的实验室已遍及全国各级医疗、疾病预防控制、采供血、妇幼保健机构，出入境检验检疫、军队等各个系统。

为了尽早发现HIV感染者和艾滋病病人，及早提供咨询、治疗，同时为适应基层艾滋病检测工作需求，在新的形势下，根据《关于艾滋病抗病毒治疗管理工作的意见》、《中国预防与控制艾滋病中长期规划（1998—2010年）》、《中国遏制与防治艾滋病十二五行动计划的通知（国办发[2012]4号）》、“四免一关怀”等国家艾滋病防治重要方针政策和十三五防治工作重点，在广泛征求各省、市疾病预防控制机构和医疗机构意见的基础上，在中华人民共和国卫生和计划生育委员会艾滋病专家及省级专家的参与下，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心对《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》进行修改、增补和完善，制定出《全国艾滋病检测技术规范（2015年版）》（以下简称《规范》），使其既能满足目前艾滋病检测工作的实际需求，又能体现检测技术的发展。

本次《规范》修订工作立足于我国目前检测状况，结合发达国家使用的指南，主要对以下几个方面内容进行了修改、增补和完善：

（1）完善了不同的检测策略，并将其整合为独立的一章；

（2）增加了HIV-1新发感染检测一章；（3）新增了补充试验概念,其内容包括抗体确证试验（WB，RIBA/LIA等）和核酸试验（定性和定量试验）；（4）增加了第4代试剂（抗原抗体联合检测试剂）的检测流程；（5）增加了核酸检测流程；（6）完善了检测报告。

将抗体筛查和复检报告整合为HIV抗体筛查检测报告，增加了HIV-1核酸检测报告和婴儿艾滋病病毒感染早期诊断检测报告，取消了流行病检测HIV抗体检测报告单、艾滋病病毒抗体检测数和阳性人数统计报表、艾滋病职业暴露个案登记表和艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表；（7）取消了实验室生物安全一章和艾滋病检测实验室质量管理一章。

所有附表的检测报告仅供使用实验室参考。

本《规范》由中国疾病预防控制中心批准,下发至全国艾滋病检测实验室及有关单位。

本《规范》将为国家、相关部委下发的艾滋病防治工作各项政策法规的有效实施提供强有力的技术支持，并具体指导艾滋病实验室技术人员开展日常工作。

本《规范》起草单位：

中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。

本《规范》参加编写单位：

中国人民解放军军事医学科学院、上海市疾病预防控制中心、中国医科大学、北京出入境检验检疫局、云南省疾病预防控制中心、四川省疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制中心、河南省疾病预防控制中心、北京市红十字血液中心、卫生部临床检验中心、江苏省疾病预防控制中心、陕西省疾病预防控制中心、安徽省疾病预防控制中心、首都医科大学附属北京佑安医院、北京市疾病预防控制中心。

本《规范》编写组人员：

蒋岩、汪宁、李敬云、钟平、尚红、邵一鸣、肖瑶、朱红、邢文革、姚均、潘品良、邱茂锋、马艳玲、梁姝、郭志宏、王哲、葛红卫、王盈、李金明、徐晓琴、常文辉、吴建军、张福杰、吴昊、苏雪丽、廖玲洁。

本《规范》参加编写主要国际机构：

世界卫生组织（Po-linCHAN、张岚）。

美国疾病预防控制中心GAP项目（ColinShepard、郝玲、齐明山）。

本《规范》编写工作联系人：

肖瑶。

本《规范》自发布之日起实施，同时终止《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》。

本《规范》适用于全国艾滋病检测实验室。

本《规范》解释权属于中国疾病预防控制中心。

致谢：

感谢盖茨基金会在《规范》修订过程中给予技术和人力等方面的支持。

目录

第一章样品的采集和处理1

1范围1

2规范性文件引用1

3样品种类及相应的用途1

4操作步骤2

4.1采样前准备2

4.2样品的采集和处理2

4.3样品的保存4

4.4样品的运送4

4.5样品的接收5

第二章HIV抗体检测6

1范围6

2规范性文件引用6

3HIV抗体检测实验室要求6

4HIV抗体检测的目的和要点6

4.1HIV抗体检测的目的6

4.2HIV抗体检测的要点7

5常规HIV抗体检测方法7

5.1试剂和样品7

5.2方法7

6结果报告9

6.1筛查报告9

6.2确证报告9

7质量控制10

7.1酶免或发光法抗体检测的室内质量控制10

7.2快速法抗体检测质控12

第三章HIV-1新发感染检测14

1范围14

2规范性文件引用14

3新发感染检测实验室要求14

4目的14

5新发感染检测方法14

5.1方法学原理14

5.2方法15

5.3样品的入选标准和排除标准15

5.4结果处理和解释16

5.5数据分析17

6质量控制19

6.1人员培训19

6.2样品质控19

6.3试剂质控19

6.4实验过程质控20

第四章HIV-1抗原检测21

1范围21

2规范性文件引用21

3HIV-1P24抗原检测的意义21

4实验室要求21

5检测方法及程序21

5.1试剂21

5.2样品21

5.3定性检测21

5.4定量检测23

5.5结果报告和解释23

6质量控制23

6.1定性检测23

6.2定量检测24

第五章HIV核酸检测25

1范围25

2规范性文件引用25

3核酸检测的意义26

3.1HIV-1感染诊断26

3.2治疗效果监测26

3.3病程监控及预测26

3.4耐药性监测27

4HIV核酸检测实验室要求27

4.1实验室的设计及工作基本原则27

4.2实验室人员和要求27

4.3实验室生物安全27

5HIV-1核酸检测方法及程序27

5.1HIV-1核酸定性检测27

5.2HIV核酸定量检测28

5.3集合核酸定性检测30

5.4　HIV核酸即时检测31

6　质量保证和质量控制31

6.1实验室分区和环境31

6.2　仪器设备质量控制31

6.3检测过程质量控制31

6.4外部质量控制32

第六章艾滋病病毒感染实验室检测策略33

1范围33

2规范性文件引用33

3疫情监测相关的检测策略及结果报告33

3.1　HIV匿名无关联检测流程33

3.2HIV实名关联检测流程34

4临床诊断相关的检测策略及结果报告34

4.1使用抗体检测试剂的筛查检测流程34

4.2使用抗原抗体检测试剂的筛查检测流程35

4.3补充试验检测策略37

5血液筛查相关的检测策略及结果报告40

6婴儿HIV-1感染早期诊断相关的检测策略及结果报告42

6.1核酸检测策略（RNA/DNA）及结果报告42

6.2抗体检测策略及结果报告44

第七章HIV-1基因型耐药检测46

1范围46

2规范性文件引用46

3HIV-1基因型耐药检测的意义46

3.1群体耐药监测46

3.2个体耐药检测47

4HIV-1基因型耐药检测实验室要求47

4.1实验室功能分区47

4.2实验室人员和要求48

4.3设施和设备48

5HIV-1基因型耐药检测方法及程序48

5.1样品48

5.2检测原理48

5.3检测方法48

5.4耐药分析49

6质量保证与质量控制49

6.1室内质控50

6.2外部质控50

第八章CD4+和CD8+T淋巴细胞检测51

1范围51

2规范性文件引用51

3CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的意义51

3.1HIV感染临床分期51

3.2HIV感染儿童免疫抑制分级和治疗辅助指标51

3.3疾病进展监测52

3.4机会性感染的风险评估52

3.5抗病毒治疗适应症选择及疗效评价52

3.6CD8+T淋巴细胞为抑制性/细胞毒性T细胞52

4CD4+和CD8+T淋巴细胞检测实验室要求52

4.1人员52

4.2功能分区53

4.3设施和设备53

5常规CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的方法和程序53

5.1样品采集、运输和接收53

5.2方法54

5.3试剂55

5.4实验资料的记录55

5.5结果报告55

6质量控制56

第九章HIV-1的分离培养57

1范围57

2规范性文件引用57

3HIV-1分离的意义57

3.1HIV抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断及诊断57

3.2HIV表型耐药检测及其他HIV生物学特征的研究57

3.3HIV感染的辅助诊断57

4实验室要求57

4.1实验室57

4.2设备57

4.3材料57

5HIV-1分离的方法及程序57

5.1样本57

5.2靶细胞制备57

5.3建立共培养58

5.4监测病毒生长58

5.5病毒鉴定58

5.6判定结果和解释58

6质量控制58

附表1HIV抗体筛查检测报告59

附表2HIV抗体确证检测报告60

附表3HIV-1核酸检测报告61

附表4HIV抗体确证检测报告（特定条件）62

附表5CD4+T淋巴细胞检测报告63

附表6HIV-1耐药基因型检测报告64

附表7婴儿艾滋病病毒感染早期诊断检测报告65

第一章样品的采集和处理

1范围

本章规定了用于人免疫缺陷病毒（HIV）检测的全血、血清、血浆、细胞、口腔黏膜渗出液、尿液以及滤纸干血斑（DBS）样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体、抗原、核酸、基因亚型、耐药检测、CD4+和CD8+T淋巴细胞数测定及HIV分离培养。

2规范性文件引用

《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》中华人民共和国卫生行业标准WS-293有效版本。

《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量及保证指南》（中国疾病预防控制中心，2013年版）。

《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》（中国疾病预防控制中心，2013年版）。

《HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》，（中国疾病预防控制中心，2013年版）。

ConsolidatedGuidelinesonHIVTestingServices.WHOJuly2015.

《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》，卫生部第45号令,2006年2月1日。

3样品种类及相应的用途

3.1全血、血清、血浆、口腔黏膜渗出液、尿液以及干血斑样品可用于HIV抗体检测。

3.2全血、血清、血浆、病毒培养上清液可用于HIV抗原检测。

3.3抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。

3.4血浆、DBS可用于HIV-1病毒载量、基因型、耐药检测。

3.5淋巴细胞富集液、外周血单核淋巴细胞（PBMC）及全血可用于HIV核酸定性与定量、基因型检测和HIV-1分离培养。

4操作步骤

4.1采样前准备

根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术要求操作，遵守生物安全相关要求。

检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间及唯一编码。

采集血液样本宜选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。

口腔黏膜渗出液样本应使用试剂盒提供的专用采样工具，尿液样本建议使用可保持尿液稳定的专用采尿管。

4.1.1样品的编码和记录

4.1.2应制定样品编码的标准操作程序（SOP），规定样品编码的原则和方法，为样品制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。

4.1.3采血前，先对试管或滤纸进行标记，核对后编码。

要将标签贴在试管的侧面，推荐使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。

干血斑滤纸应使用具有资质的产品。

4.1.4口腔黏膜渗出液样本应采集口腔渗出液,不是唾液。

4.1.5尿液样本准备好带有唯一编码的采尿管，并保留唯一编码。

4.1.6应使用专门的样品记录本或登记表记录样品，同时录入电脑保存。

4.2样品的采集和处理

4.2.1血液

4.2.1.1抗凝全血：

消毒局部皮肤，用加有抗凝剂（EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠）的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀6～8次，备用。

4.2.1.2末梢全血：

消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或食指。

1岁以下儿童采用足跟部）。

用采血针刺破皮肤，用无菌纱布擦掉第一滴血。

收集滴出的血液，备用。

4.2.1.3血浆：

将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15分钟，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。

4.2.1.4血清：

根据需要，用不含抗凝剂的真空采血管抽取5～10ml静脉血，或一次性注射器抽取静脉血，转移至无抗凝剂的试管中，室温下自然放置1～2小时，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15分钟，吸出血清，置于合适的容器中，备用。

4.2.1.5淋巴细胞富集液：

将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15分钟，吸取血浆层下的淋巴细胞富集液，置于合适的容器中，备用。

4.2.1.6PBMC：

使用淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心，吸出PBMC层，置于合适的容器中，备用。

4.2.1.7抗凝剂的选择：

根据检测要求选用适当的抗凝剂，如CD4+和CD8+T淋巴细胞测定可选用EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠；HIV-1病毒分离、核酸定性/定量检测可选用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠。

4.2.1.8样品采集后处理、保存、运输的时限和条件，因不同的检测项目而异，应参见不同检测项目要求。

4.2.1.9采血完成后的穿刺针头必须丢弃于放置尖锐危险品容器内，妥善处理，防止发生职业暴露。

4.2.2滤纸干血斑

4.2.2.1根据需要，可将采集的各种血液样品制备成滤纸干血斑，用于检测。

最常用的是用抗凝全血、末梢全血和血浆制备滤纸干血斑。

4.2.2.2用移液器从样品管中吸取100μL抗凝全血（或血浆），对准滤纸印圈的中心处，将样品滴在滤纸上，或将穿刺后自皮肤伤口流出的末梢全血直接滴加在滤纸印圈的中心处。

4.2.2.3根据需要，连续在数个印圈上滴加样品。

4.2.2.4于室温下自然干燥至少4小时（潮湿气候下至少干燥24小时），不要加热或堆叠血斑，勿与其它界面接触。

4.2.2.5血斑充分干燥后，将其放入密封袋中，每张干血斑单独保存，避免血斑之间的相互污染，同时放入干燥剂及湿度指示卡，密封包装，保存备用。

4.2.3尿液和口腔黏膜渗出液

4.2.3.1尿液：

推荐使用专用采尿管，保持尿液稳定。

尿液样品可采集随机尿，女性经期应取中段尿。

4.2.3.2口腔黏膜渗出液：

使用试剂盒提供的容器收集样品。

存放时间和是否冻存以试剂盒说明书为准。

口腔黏膜渗出液应采集口腔渗出液,不是唾液。

4.3样品的保存

4.3.1用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于2～8℃，一周以上应存放于-20℃以下。

4.3.2用于核酸检测的血浆和血细胞样品4天内进行检测的可存放于4℃，3个月以内应存放于-20℃以下。

3个月以上应置于-70℃以下保存。

4.3.3口腔黏膜渗出液样品应即刻使用，需要保存应以产品说明书为准。

4.3.4尿液样品，使用专用采尿管，室温下可保存2周，一年之内存放宜在2～8℃。

长期保存（一年以上）的样本冻存条件、是否添加防腐剂等以产品说明书为准。

4.3.5用于CD4+T淋巴细胞检测的全血样品，室温保存，时间不超过24小时。

如果用CD45设门，样品保存不超过72小时。

4.3.6筛查阳性样品应及时进行补充试验，筛查阴性样品，可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存1个月。

特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。

补充试验阳性样品按照国家生物样品管理的有关规定执行。

4.4样品的运送

4.4.1全血、血浆的运送应符合生物安全要求，参照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部第45号令,2006年2月1日执行）。

4.4.2血液样品运送时应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。

送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。

4.4.2.1第一层容器：

直接装样品，应防渗漏。

样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。

在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。

4.4.2.2第二层容器：

容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。

要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。

4.4.2.3第三层容器：

容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。

外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样，还应易于消毒。

4.4.2.4用于抗体检测的血清和血浆样品应在冻存条件下运送用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下（18～25℃）运送。

用于病毒载量检测的样品应在-20℃以下运输。

DBS和尿液样品应在室温下（18～25℃）运送，可通过邮寄方式运送。

4.4.2.5运送样品必须有记录。

4.5样品的接收

4.5.1样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的工作人员打开，打开包裹时应穿戴防护衣、戴口罩和防护眼镜，在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。

4.5.2核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。

如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。

4.5.3检查样品的状况，记录血液样品有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。

记录干血斑和尿液样品包装是否完整，如果污染过重或者不符合接收要求，应将样品安全废弃。

并立即将样品情况通知送样人，要求重新采集样品。

4.5.4接收样品时应填写样品接收单。

第二章HIV抗体检测

1范围

本章规定了HIV抗体的检测方法、结果报告及质量控制。

适用于各级各类医疗、疾病预防控制、检验检疫、采供血及卫生保健机构。

可作为对HIV感染者诊断和监测的实验室依据。

2规范性文件引用

《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》（中华人民共和国卫生行业标准，WS293-有效版本）。

ConsolidatedGuidelinesonHIVTestingServices.WHOJuly2015

StatementfromtheSurveillanceandSurveyWorkingGroupandtheLaboratoryWorkingGrouptotheOfficeoftheGlobalAIDSCoordinator.26Nov.2006.

GuidelinesforusingHIVtestingtechnologiesinsurveillance.UNAIDS/WHO.2009.

《艾滋病病毒抗体快速检测技术手册》（中国疾病预防控制中心，2011年版）

3HIV抗体检测实验室要求

应符合国家对实验室生物安全的有关要求。

实验室的质量控制按本规范相关章节规定执行。

4HIV抗体检测的目的和要点

4.1HIV抗体检测的目的

4.1.1HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。

4.1.2以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。

4.1.3以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。

4.1.4以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。

4.2HIV抗体检测的要点

4.2.1根据目的选择检测方法及检测策略。

4.2.2严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。

4.2.3结果判定以试剂盒说明书为标准。

4.2.4筛查试验有反应，须作补充试验。

补充试验是通过检测样本中是否存在艾滋病病毒抗体、抗原或者核酸而确定艾滋病病毒感染的检测方法。

补充试验包括抗体确证试验（免疫印迹试验，条带/线性免疫试验，特定条件*下的替代检测，免疫层析或免疫渗滤试验）和核酸试验（核酸定性和核酸定量试验）。

替代检测包括三种酶联免疫试验、三种快速试验或酶联免疫加快速试验。

*特定条件：

高流行地区（流行率大于5%）、高危人群（如男男同性恋，吸毒人群）、三种试剂均经过使用地区中心实验室评价。

4.2.5筛查试验无反应，不应做补充试验。

4.2.6对筛查及补充试验对象均应做好咨询工作。

5常规HIV抗体检测方法

5.1试剂和样品

必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。

推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的方法及试剂。

样品可采用血清、血浆、全血、滤纸干血斑、口腔黏膜渗出液和尿液。

5.2方法

5.2.1筛查方法

5.2.1.1酶联免疫吸附试验（ELISA）

这类试验可使用血液（包含血清、血浆和滤纸干血斑）、尿液样品，ELISA多为HIV抗体检测试剂。

HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。

HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原/抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。

有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。

5.2.1.2化学发光或免疫荧光试验（CIA/IFA）

这类试验采用发光或荧光底物，可使用血液（包含血清和血浆）、尿液样品，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。

HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原/抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。

有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。

5.2.1.3快速检测（RT）及其它试验

这类试验可使用血液、口腔黏膜渗出液，操作简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测、VCT及检测点等。

一般可在10～30分钟内得出结果。

明胶颗粒凝集试验（PA）：

是HIV抗体检测的一种简便方法。

将HIV抗原致敏的明胶颗粒，与待检样品作用。

当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。

PA试剂有两种:

同时检测HIV-1和HIV-2抗