浅论GITR mRNA 在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平.docx

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浅论GITRmRNA在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平

浅论GITRmRNA在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平

【摘要】目的：

探讨糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoidinducedtumornecrosisfactorreceptor,GITR）与变应性鼻炎（allergicrhinitis,AR）的关系。

方法：

采用实时荧光定量PCR方法检测变应性鼻炎未治疗组（n=23，男12例，平均年龄34岁）、临床缓解组（n=17，男8例，平均年龄31岁）及正常对照组（n=24，男11例，平均年龄28岁）外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中GITRmRNA的相对表达水平。

结果：

变应性鼻炎未治疗组GITRmRNA相对表达水平明显高于变应性鼻炎临床缓解组和正常对照组（，），而变应性鼻炎临床缓解组GITRmRNA相对表达水平与正常对照组相比较，差异无统计学意义（）。

结论：

GITR可能参与了变应性鼻炎的病理过程，具体机制有待进一步研究。

【关键词】糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体;变应性鼻炎;外周血单个核细胞;实时定量PCR

　　[Abstract]Objective:

Tofindoutthecorrelationbetweenglucocorticoidinducedtumornecrosisfactorreceptor（GITR）andallergicrhinitis（AR）.Methods：

Thirtythree（male12,average34yearsold）patientswithactiveAR,17ARpatientswithsymptomscontrolled（male8,average31yearsold）,and24normalcontrols（male11,average28yearsold）wererecruitedinthestudy.TherelativeexpressionofGITRmRNAinperipheralbloodmononuclearcellswasdetectedbymeansofrealtimefluorescencequantitativePCRmethod.Results：

TherelativeexpressionsofGITRmRNAinthegroupofARpatientswithouttreatmentweresignificantlyhigherthanthatinthegroupsofARpatientswithsymptomscontrolledandnormalcontrols（,respectively）,buttherewasnostatisticallysignificantdifferenceinrelativeexpressionofGITRmRNAbetweenthegroupsofARwithsymptomscontroledandnormalcontrol（）.Conclusion：

GITRmightbeinvolvedinthepathologicalprocessofAR.TheroleofGITRinprocessofARremainsfurtherinvestigation.

　　[Keywords]glucocorticoidinducedtumornecrosisfactor;allergicrhinitis;peripheralbloodmononuclearcell;realtimequantitativePCR

　　糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoidinducedtumornecrosisfactorreceptor,GITR）为肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员，又被称为TNFRSF18。

1997年,Nocentini等[1]在地塞米松处理的T细胞杂交瘤中克隆出GITR。

1999年以来,人类和鼠类的GITR配体（GITRL）也分别被克隆出来[2-3]。

Shimizu等报道GITR持续高表达于CD4+CD25+Treg表面,并能有效地消除Treg细胞的免疫抑制功能。

Patel等以抗GITR单抗注入关节炎鼠模型后，炎症恶化，同时伴有肿瘤坏死因子、干扰素、胶原特异性IgG1的升高。

此外，GITR单抗刺激同样可以加剧卵清蛋白（OVA）诱导的鼠哮喘模型的气道炎症，多种炎性细胞因子分泌增多。

在体外试验中，研究者观察到转录因子Tbet和GATA3的表达。

这些试验结果均提示GITR信号参与Th1和Th2的炎症反应。

因此GITR/GITRL在免疫调节中的作用,以及GITR与Th细胞的相关性受到免疫学研究者的高度关注。

但是近年来的相关研究结果多数是在动物细胞和动物模型上获得的,有关人类GITR/GITRL在免疫调节中的作用,特别是在变态反应疾病等病理情况下如何变化的研究报道不多。

因此，我们采用实时荧光定量PCR技术检测变应性鼻炎（allergicrhinitis,AR）患者外周血单个核细胞中GITRmRNA的相对表达水平，从而探讨其在变应性鼻炎中的表达变化以及其与变应性鼻炎发生、发展的相关性。

　　1材料和方法

　　研究对象

　　变应性鼻炎患者未治疗组按照中华医学会耳鼻喉科学分会2004年兰州会议变应性鼻炎诊断标准，选择2008年1月至2008年10月在镇江市第一人民医院就诊的23例患者，男12例，女11例，年龄12～56岁，平均34岁，均有变应性鼻炎典型症状，经过粉尘螨、屋尘螨、豚草等20种常见阳性变应原血清特异性IgE检测，至少一种为阳性。

　　正常对照组24例中，男11例，女13例,年龄16～42岁，平均28岁。

均无变应性鼻炎病史及哮喘、特应性皮炎等其他变应性疾病史，变应原血清特异性IgE过筛试验检测阴性。

　　临床缓解组为AR发作期患者经皮质类固醇激素鼻喷剂等药物治疗后临床症状缓解1月后复诊，并经表1疗效评分标准显示为有效或显效的患者。

　　AR临床治疗缓解组患者的筛选根据症状和体征记分评定疗效，记分方法见表1。

表1AR症状和体征评分方法　疗效评定标准:

治疗前总分-治疗后总分治疗前总分×100%

　　计算值≥66%为显效，65%～26%为有效，≤25%为无效。

　　23位AR未治疗组经治疗后17例显效，3例有效，3例无效，20例有效或显效患者停药1月后有3例重新出现部分症状且评分低于显效标准。

我们去除无效及症状复发的，取17例（男8例，女9例,年龄12～48岁,平均年龄31岁）显效和有效且停药1月症状未复发的为临床缓解组。

　　主要试剂和仪器

　　Trizol（Invitrogen公司），Ficoll淋巴细胞分离液（天津灏洋生物技术有限公司），逆转录试剂盒（ToYoBo公司），SYBRGreenIRealTimePCRKit（杭州Bioer公司），rTaq酶、dNTP、10×缓冲液、pMD18T（TakaRa公司），RotorGeneRG6000荧光定量PCR仪（澳大利亚Corbett公司）。

　　标本处理

　　取外周静脉血5ml经肝素抗凝后，按照Ficoll淋巴细胞分离液说明书操作分离PBMC，然后，加入1mlTrizol试剂裂解细胞，严格按照说明书操作提取PBMC中总RNA。

最后，利用逆转录试剂盒将总RNA逆转成cDNA，其中，在20μl的逆转反应体系中加入1μg总RNA为模板，合成的cDNA于-80℃冰箱保存备用。

　　引物设计及合成

　　利用primerprimer软件根据NCBI基因库中GITR和β肌动蛋白mRNA序列分别设计定量PCR引物，其中GITR：

上游5′GGGTCGGGATTCTCAGGTCA3‘;下游5‘CGGGTTTCAAGAGCCCACAG3‘;扩增片段103bp。

β肌动蛋白：

上游5‘CACGAAACTACCTTCAACTCC3‘;下游5‘CATACTCCTGCTTGCTGATC3‘;扩增片段262bp。

　　构建标准质粒

　　以上述制备的cDNA为模板，利用PCR扩增GITR和β肌动蛋白，反应体系均为10×缓冲液2μl，μl，上下游引物（20μmol/L）各μl，cDNA模板1μl，rTaq酶（5U/μl）μl，ddH2O补足至20μl。

其中GITR反应条件：

94℃5min，94℃30s，63℃30s，72℃30s，共40循环。

β肌动蛋白反应条件：

94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，共30循环。

以上述PCR产物分别与pMD18T载体进行TA克隆，并将筛选出来的阳性克隆稀释后作为标准质粒于-20℃冰箱保存备用。

　　制备标准曲线

　　以上述稀释的标准质粒作为模板在荧光定量PCR仪上采用四步法进行SYBRGreenⅠ实时定量PCR来制备标准曲线。

反应体系如下:

2×SYBR混合物10μl，上下游引物（20μmol/L）各μl，Taq酶μl，cDNA或标准质粒1μl，ddH2O补足至20μl。

其中，GITR反应条件：

94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃30s，88℃8s，扩增40循环。

β肌动蛋白反应条件：

94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，86℃8s，共30循环。

　　标本GITRmRNA相对表达量测定

　　将标本cDNA与标准质粒按照上述反应体系和反应条件同时进行扩增,根据标准曲线分别检测标本中GITR和β肌动蛋白mRNA拷贝数/μl，最后以β肌动蛋白为参照来校准目的基因GITR相对表达。

　　统计学处理

　　3组数据比较利用软件中KruskalWallisH检验，3组数据进行两两比较利用Nemenyi法检验，采用Spearman秩相关分析，以为差异有统计学意义。

　　2结果

　　AR未治疗组、AR临床缓解组和正常对照组GITRmRNA相对表达的比较

　　AR未治疗组、AR临床缓解组和正常对照组3组GITRmRNA相对的表达结果如图1所示。

3组间GITRmRNA相对表达水平比较差异有统计学意义（χ2=，）。

其中，AR未治疗组GITRmRNA相对表达水平明显高于临床缓解组和正常对照组（χ2=，;χ2=，）。

而临床缓解组GITRmRNA相对表达水平与正常对照组相比较，差异无统计学意义（χ2=，）。

　　AR患者GITRmRNA相对表达水平与症状体征记分相关性分析

　　AR患者未治疗组GITRmRNA相对表达水平与症状体征记分相关性如图2所示，两者呈正相关（n=23,r=,）。

　　3讨论

　　GITR在鼠和人Treg细胞上组成性高表达[8-10],在小鼠体内，活化GITR信号，可遏制多克隆的或抗原特异性的鼠Treg细胞的抑制功能，而在人类，GITR信号并不干扰Treg的抑制活性，这显示GITR信号对Treg细胞的作用有着物种间的差异[11]。

然而，无论在小鼠还是人类，在受到刺激后，Th细胞表面GITR的表达均出现上调[11]，且GITR信号与CD28的共刺激信号还有一定的协同作用[12]，表明GITR信号对效应性T细胞具有明显的活化作用，参与了效应性T细胞的炎性反应。

变应性鼻炎是耳鼻咽喉头颈外科的常见病之一，临床上以鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进、鼻黏膜肿胀为主要特点，可分为常年性变应性鼻炎和季节性变应性鼻炎,其中约20%为季节性，40%左右为常年性，其余约40%为两者并存[13]。

该病发病率有逐年增加的趋势[13]。

细胞因子在气道变态反应疾病的免疫病因学中起着重要的作用,呼吸道上皮细胞是呼吸道炎症应答反应的主要调节者,前炎症因子、介质和环境因素如病毒、过敏、吸烟和空气污染等刺激使呼吸道上皮细胞产生生物活性介质,参与了免疫调节及炎性反应[14]。

　　综上研究，理论上讲GITR信号与变态反应疾病应该是有密切相关性的，而目前现有的证据仅停留在实验阶段。

尽管GITR在免疫调节中的作用仍未完全清楚，但本研究通过实时荧光定量PCR方法检测，显示AR未治疗组GITRmRNA相对表达水平明显高于临床缓解组和正常对照组，临床缓解组GITRmRNA相对表达水平与正常对照组相比较差异无统计学意义，提示变应性鼻炎患者体内由于GITR信号的活化抑制了Treg细胞，免疫调节功能下调，使得Th2细胞逃脱了抑制，从而造成了免疫紊乱，产生了一系列临床症状，而治疗后症状缓解的患者GITRmRNA表达水平恢复正常，Treg细胞发挥正常免疫调节功能，抑制了Th2细胞，从而抑制了变应性鼻炎的发病过程。

但这种表达水平的下降与症状缓解之间的联系是由GITR信号变化所引起，抑或由皮质类固醇激素对免疫系统的调节所引起，目前还不能肯定，因为尽管我们在使用皮质类固醇激素治疗后停药1个月，仍然不能完全忽视其在免疫反应中可能产生的作用。

同时，尽管本研究提示AR患者GITRmRNA相对表达水平与疾病的发生、发展有一定的相关性，但为证明GITR在变应性疾病中的作用，我们将利用GITR多克隆抗体进行进一步的实验[15]。

总之，本次研究认为GITR可能参与了AR的病理过程，从而为深入研究AR免疫调节病理机制奠定了一定基础，为临床治疗变态反应疾病提供了新的思路。

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