转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展_精品文档.doc

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转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展

随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。

植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。

通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。

因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。

至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。

到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达1．02亿hm2，比2005年增长13％，是1996年的62倍。

转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。

植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。

本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。

1外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定

1．1PCR（p01ymerasechainreaction）检测

1．1．1常规PCR

PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤（即变性、退火和延伸）完成的反复循环。

经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。

根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。

由于PCR检测所需的DNA用量少，纯度要求也不高，不需用同位素，实验安全，操作简单，检测灵敏，效率高，成本低，使之成为当今转基因检测不可或缺的方法，被广泛应用。

然而，PCR检测易出现假性结果。

引物设计不合理，靶序列或扩增产物的交叉污染，外源DNA插入后的重排、变异等因素都会造成检测的误差。

因此常规PCR的检测结果通常仅作为转基因植物初选的依据，有必要对PCR技术进行优化，并对PCR（real-timequantitativePCR）检测为阳性的植株做进一步验证。

1．1．2优化的PCR

PCR技术的优化目的在于提高扩增产物的特异性、推测目的基因的拷贝数及整合情况，从而提高检测的效率。

常见的有多重PCR（MultiplexPCR，MPCR）、降落PCR（TouchdownPCR，TD-PCR）、rpPCR、反向PCR（inversePCR，IPCR）、实时定量PCR等。

1．1．2．1多重PCR

MPCR是在同一管PCR反应体系中，使用多套针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行PCR扩增的方法。

与普通PCR法相比，MPCR反应更快捷，更经济，只需1次PCR反应，就能检测多个靶基因。

Matsuoka等用该方法同时扩增出了转基因玉米的5种外源基因Btll，Btl76Mort810，T25andGA21。

陈明洁等用MPCR对转基因小麦植株的报告基因uidA和选择基因hat进行扩增，MPCR的检测结果与单基因的PCR检测结果完全一致。

由于MPCR技术是在同一反应管中加多对引物同时对多个靶位点进行检测，因此对引物的要求较高，不同引物间的相互干扰应降至最低；同时扩增的目的片段大小也不能太接近，否则凝胶电泳时难以分开，无法辨别。

1．1．2．2降落PCR

TD-PCR是一种在一个反应管或少数几个反应管中通过一系列退火温度逐渐降低的反应循环来达到最佳扩增目的基因的PCR方案。

它通过体系自身的代偿功能弥补以反应体系和并非完美的循环参数所造成的不足。

此策略保证了最初形成的引物模板杂交体具最强的特异性。

尽管最后一些循环采用的退火温度会降到非特异的Tm值，但此时的扩增产物已开始几何扩增，在余下的循环中处于超过任何非特异性PCR产物的地位，从而使PCR产物仍然呈现出特异性扩增。

R．H．Don等认为，PCR过程中的前几个循环对于扩增产物的纯度非常重要，因此前几个循环较高的退火温度，会增加引物与模板结合的特异性，TD-PCR方法可以阻止非特异性产物的形成。

由于TD-PCR的策略是在较早的循环中避免低Tm值配对，故在TD—PCR中必须采用热启动技术。

田路明等用TD-PCR对高羊茅转基因植株两个片段进行了扩增，结果表明TD—PCR能快速准确检测转基因植株。

1．1．2．3rpPCR

F}1于外源基因整合到目标基因组时常发生重排，因此Southern杂交并不能清楚地分析转基因的拷贝数和整合情况。

Kumar和FladungIvl在研究转基因杨树的外源基因整合行为时发明了rpPCR方法。

这种方法就是利用不同的引物进行配对，对基因组DNA扩增，根据不同的引物对的扩增情况及产物的大小来推定T-DNA的拷贝数、整合情况及拷贝的完整性等信息。

与Southern杂交相比，该法的优点在于能比较方便快捷地指出重复单位是否完整，并能表明这种重复的方向。

此方法的不足之处是在有多拷贝整合在不同的染色体上时不能显示作用㈣。

1．1．2．4反向PCR

IPCR与普通PCR相同之处是都有一个已知序列的DNA片段，引物都分别与已知片段的两末端互补。

不同的是对该已知片段来说，普通PCR两引物的3、一末端是相对的，而IPCR则是相互反向的。

因而IPCR可以扩增已知序列片段旁侧的未知序列。

根据这一特点，可以对外源基因在植物基因组中整合的拷贝数进行分析，多拷贝多位点整合时，扩增产物在电泳图谱上呈现多条带，单拷贝时只得到一条带。

然而，该技术要求DNA模板复杂度低于109bp，如果高于此值，则不能获得理想的效果。

另外，自连接（环化）的效率也是限制该技术成功的因素。

1．1．2．5实时定量PCR

实时定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法…1。

其特点是：

特异性好，实时定量PCR技术通过引物或和探针的特异性杂交对模板进行鉴别，具有很高的准确性，假阳性低；灵敏度高，采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控；线性关系好，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小；操作简单，自动化程度高，实时定量PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少；没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。

Ingham等研究发现可用双向实时定量PCR检测转基因植物中的外源基因拷贝数。

他们通过对37个株系的实时定量PCR检测，发现仅有2个株系是由于多个拷贝同时插人到了1个位点而与Southern结果不符，其余35个株系的双向实时定量PCR检测结果与Southern结果高度吻合，表明实时定量PCR技术可用于检测转基因植物的拷贝数。

杜春芳等则建立了一种双重定量PCR技术鉴定转基因植物纯合子的新方法，该方法能鉴定出转基因植株是纯合型还是杂合型，并能准确鉴定出转化植株外源基因的拷贝数，为鉴定转基因植物的整合性提供了方便。

1．2Southern杂交

Southern杂交是利用经过标记的DNA、RNA探针与靶DNA进行特异性杂交，分析外源基因在植物染色体上的整合情况（如拷贝数、插人方式）以及外源基因在转基因后代的稳定性问题。

Southern杂交可以不受操作过程中的DNA污染影响和清除转化中的质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高同，特异性强，是研究转基因植株外源基因整合最可靠的方法。

已广泛应用于水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、桃等各类作物转基因植株的检测。

然而该方法程序复杂，成本高，且对实验技术条件要求较高，使其使用受到了限制。

2外源基因在转化植株中是否转录的检测与鉴定

2．1Northern杂交

外源基因在转化植株中的转录水平可以通过细胞总RNA和mRNA与探针杂交来分析，称为Northern杂交，它是研究转基因植株中外源基因表达及调控的重要手段。

Northern杂交程序一般分为三个部分：

植物细胞总RNA的提取探针的制备印迹及杂交。

Northem杂交比Southern杂交更接近于目的性状的表现，因此更有现实意义。

如竺晓平、孙辉、刘君等用Northem杂交分别对马铃薯、水稻、烟草的目的基因表达进行了鉴定。

但Northern杂交的灵敏度有限，对细胞中低丰度的mRNA检出率较低。

因此在实际工作中更多的是利用RT-PCR（reversetranscriptionPCR）技术对外源基因的转录水平进行检测。

2．2RT—PCR

RT-PCR的原理是在反转录酶作用下，以待检植株的mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板扩增出特异的DNA。

因此，RT-PCR可在mRNA水平上检测目的

基因是否表达。

RT-PCR十分灵敏，能够检测出低丰度的mRNA，特别是在外源基因以单拷贝方式整合时，其mRNA的检出常用RT-PCR。

SamiaDiennane等把烟草硝酸还原酶基因Nia2经农杆菌介导导人马铃薯，经RT-PCR分析，Nia2基因在转基因马铃薯体内RNA水平得到表达。

周苏玫等。

以皖麦48为受体导人反义trxs基因，研究抗穗发芽特性，用RT-PCR检测trxs基因的转录水平，结果表明反义trxs基因正常表达的阳性植株，lrxs基因mRNA的丰度极显著降低，从而起到抵制穗发芽的作用。

由于RT-PCR是在总RNA或mRNA水平上操作，检测过程中必须注意RNA的降解和DNA的污染，另外还要设置严格的对照来防止假性结果的出现。

3转基因植株外源基因表达情况的检测与鉴定

尽管在mRNA水平也能一定程度地研究外源基因的表达，但存在mRNA在细胞质中被特异性地降解等情况，mRNA与表达蛋白质的相关性不高（相关系数低于0．5），基因表达的中间产物mRNA水平的研究并不能取代基因最终表达产物的研究。

转基因植株外源基因表达的产物一般为蛋白，外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能才是植物基因转化的最终目的。

外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，ELISA及Western杂交是外源基因表达蛋白检测的经典方法。

3．1ELISA检测

ELIsA是酶联免疫吸附法（enzvme—linkedimmunosorbentassays）的简称，基础是抗原或抗体的同相化及抗原或抗体的酶标记，把抗原抗体反应的高度专一性、敏感性与酶的高效催化特性有机结合，从而达到定性或定量测定的目的。

ELISA有直接法、间接法和双抗夹心法之分，目前使用最多的是双抗夹心法，其灵敏度最高。

一般ELISA为定性检测，但若作出已知转基因成分浓度与吸光度值的标准曲线，也可据此来确定样品转基因成分的含量，达到半定量测定。

该方法已在棉花、辣椒、水稻、烟草、番茄等多种转化植株的检测中应用。

使用ELISA检测外源基因表达蛋白具有便捷、灵敏、特异性好、试剂商业化程度高、成本低、适用范围广、试验结果易读等特点。

但也存在易出现本底过高，缺乏标准化等问题。

3．2western杂交

Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的蛋白质检测技术，其原理是将聚丙烯酰胺凝胶电泳（S