各种抗原的制备方法.docx

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各种抗原的制备方法

抗原的制备方法

　除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。

由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。

一、抗原的提取

　　抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。

根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：

①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。

由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。

因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。

如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。

　　抗原物质的制备，大概要经过如下过程：

①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。

③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。

现分别简述如下。

（一）材料的选择及预处理

　　选择什么材料主要根据实验目的而定。

通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。

材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。

若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。

某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。

（二）细胞的粉碎

　　除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。

不同的组织，细胞的破碎难易不一，因此所使用的粉碎方法也不完全相同。

如脑、胰、肝等比较软嫩的组织，用普通匀浆器研磨就行，肌肉、心脏等则需绞碎后再作匀浆。

现浆常用的细胞粉碎方法介绍如后。

　　1．物理法

（1）高速组织捣碎机：

通常由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃筒等组成。

把材料放于筒内（约占筒内容积的1/3）固定筒盖，开动马达，调速器由慢逐渐增至所需速度。

此法适用于内脏组织。

（2）玻璃匀浆器：

由一个内壁经过磨砂的玻璃管和一根一端为球状（球面经过磨砂）玻璃研杆组成。

把绞碎的组织置于管内，加适量溶液，插入研杆，用手或电动转动研杆，并上下移动。

用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，对大分子的破坏也少。

是粉碎少量软嫩材料（脑、胰、肝等）时常用的方法。

　　（3）超声波处理法：

多用于软嫩组织，根据不同组织采用不同频率，处理10～15min，超声波处理时溶液温度升高，使不耐热的物质失活，使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温，避免溶液内存在气泡。

核酸及某些酶对超声波很敏感，要慎用。

　　（4）反复冻融法：

把待碎样品冷却到零下15～20。

C，冻固后取出，缓慢解冻，如此反复操作，可使大部分动物性细胞及胞内的颗粒破碎，但也可使生物活性物质失活。

　　（5）冷热交替法：

把材料投入90。

C左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内，可使大部分细胞破碎。

可用于提取蛋白质和核酸。

　　2．化学和生物化学法

（1）自溶法：

把新鲜材料置于一定的pH和适宜的温度下，利用组织细胞自身的酶系统把组织破坏，使细胞内容物释放出来。

动物材料的自溶温度选在0～4℃，需加少量防腐剂，自溶时间较长，不易控制，不常用。

（2）溶菌酶处理法：

多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。

在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100μg至1mg溶菌酶，37℃，保温10min，细胞就破坏了。

此外，蜗牛酶、纤维素酶也被选作破碎细菌细胞之用。

　　（3）表面活性剂处理法：

较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。

　　（三）抗原的提取

　　提取、抽提、萃取这3个词的含义基本相同。

但一般说来，提取是指在分离纯化前期，将经过处理或粉碎了的细胞置于一定条件和溶剂中，让被提取物充分地释放出来的过程，而抽提则是贯穿于分离纯化的整个过程中，如在制备核酸过程中，用氯仿反复提取蛋白液，用苯酚反复抽提分离DNA和RNA。

影响提取的因素主要来自被提取物在提取的溶剂中的溶解度大小以及它由固相扩散到液相的难易。

一个物质在某一溶剂中的溶解度大小和该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。

一般说来，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性大分子的等电点远的pH值使溶解度增加。

因此，在不同的抗原提取过程中，所选用的溶剂的性质、pH值、离子强度、抽提温度、介电常数等因素是提取成败的重要因素。

要达到分离提纯的目的，必须灵活地应用这些因素。

　　现将蛋白质、核酸、多肽等抗原（半抗原）的提取方法概要叙述于下。

　　1．蛋白质和酶的提取　　蛋白质是由许多氨基酸连接而成的高分子物质，分子量从数千至百万。

数以千计的蛋白质，按它们的功能可分成两大类，一类是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、受体蛋白、运动蛋白、运输和贮存蛋白、防御蛋白等等，另一类是非活性蛋白，如胶原蛋白、角蛋白等，不同的蛋白质由于其结构的差异，它们溶解度也各不相同。

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于有机溶剂乙醇、丙酮、丁醇等。

这对选择撮蛋白质的溶剂具有重要意义。

（1）水溶液提取：

由于蛋白质大部分溶于水、稀酸和稀碱溶液，因此提取蛋白质以水溶液为主，其中尤以稀盐液和缓冲液对蛋白质稳定性好，溶解度大，氢是最常用的溶剂。

应注意下列几点：

①盐浓度，常用等渗溶液，尤以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液、0.15mol/L氯化钠溶液应用较多。

如酵母脱氢酶以0.66mol/L磷酸氢二钠溶液提取，6-磷酸葡萄糖脱氢酶以0.1mol/L碳酸氢钠液提取，脱氧核糖核蛋白在低盐溶液中溶解度小，就要用1mol/L以上的氯化钠液提取，而某些脂肪酶，用水提取比低盐溶液提取效果更好。

②pH值的选择对蛋白质提取颇为重要，因为蛋白质的溶解度和稳定性与pH值关系很大。

提取液的pH值首先要保证在蛋白质稳定的范畴内，通常在等电点的两侧，碱性蛋白如细胞色素C和溶菌酶选在偏酸一侧，酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶应选在偏碱一侧。

③温度：

为防止活性蛋白变性、降解而失活，温度通常选在5℃以下。

对少数耐温的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提纯，如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶以及许多多肽激素可选择37～50℃条件下提取，效果比低温提取更好。

（2）有机溶剂提取：

一些不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液的蛋白质和酶，常用不同比例的有机溶剂来提取。

如用70%～80%乙醇提取麸蛋白；用60%～70%的酸性乙醇提取胰岛素，既可抑制水解酶对胰岛素的破坏，又可除去大量杂蛋白，用丁醇提取某些附于微粒体和线粒体的酶，一些与脂质结合牢固的蛋白质和酶以丁醇提取，效果较好。

我国生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脱氢酶和碱性磷酸脂酶。

丁醇提取法对pH及温度的选择范围较广（Ph3～10）,温度由零下2℃～40℃均可。

　　2．核酸的提取　　核酸分为两大类：

一类为核糖核酸（RNA），另一类为脱氧核糖核酸（DND）。

核酸的分子量极大，人数万致亿万。

核酸是两性化合物，在一定的等电点。

溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有机溶剂。

细胞内的核酸常和蛋白质结合成核蛋白。

核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中的溶解度有显著区别，有一定浓度范围的氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度随着氯化钠浓度增加而逐渐下降，当氯化钠浓度为0.14mol/L时，其溶解度仅为水中溶解度的1/100，但当氯化钠浓度再增加时，脱氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化钠浓度增加到0.5mol/L时，其溶解度与水中溶解度相似，当氯化钠浓度增加到1mol/L时，它的溶解度比在水中大2倍。

核糖核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中仍有相当大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化钠溶液提取核糖核蛋白，而提取脱氧核糖核蛋白时，则用1mol/L氯化钠溶液。

两种核糖核蛋白的溶解度与溶液的pH也有关。

当pH为4.2时，脱氧糖核蛋白的溶解度最低，而pH为2.0～2.5时，核糖核蛋白的溶解度最低。

所以调节氯化钠溶液的浓度和pH值，可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。

（1）RNA的提取：

RNA在细胞中主要有三种类型，即rRNA（核微粒核糖核酸）、tRNA（转移核糖核酸）和mRNA（信使核糖核酸）。

mRNA代谢极不稳定，提取时要求条件较严格；tRNA当细胞破碎后，用酸处理得到“pH5”沉淀，即可从中分离tRNA；rRNA占全部RNA的80%以上，比较稳定，一般提取的大分子RNA主要为此部分。

核内rRNA常先将细胞核分离后，再进行提取，可避免其他细胞组分RNA的干扰。

　　RNA的提取，通常是用0.14mol/L氯化钠溶液将组织做匀浆并反复提取细胞质中的核糖核蛋白，而留下含有DNA的细胞核物质，然后用10%醋酸调至pH4.2沉淀，离心弃去上清液，先用0.5mol/L氯化钠溶液，后用水洗涤沉淀，将核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氢钠溶液中，离心，取上清液，调pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化钠溶液洗涤，再一次除去脱氧核糖核蛋白。

核糖核蛋白中的蛋白质可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氢钠水溶液中，加入乙醇，RNA即以钠盐形式沉淀出来。

　　提取RNA另一类方法，不须事先用0.14mol/L氯化钠提取核糖核蛋白，而一步将RNA的蛋白质分开，并同时把RNA抽提出来，此类方法是在破碎细胞做成匀浆时，加入去污剂十二烷基磺酸钠或二甲苯磺酸钠；而现在最常用的方法是直接加入含水苯酚与匀浆一起振荡，DNA和蛋白质沉淀于酚层中，水层中含RNA和多糖，然后用乙醇使RNA沉淀，四种物质一步便可初步分离开。

苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法，其应用举例如下：

　　肝脏rRNA的提取：

按肝重（鲜）加入10倍容积苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70mln-甲酚于50ml蒸馏水中，另加入0.5g8-羟基喹啉配成）及10倍容积的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/V）做匀浆后在20℃搅拌20min。

　　肝脏细胞核内mRNA的提取：

先分离细胞核，再将核悬浮于3倍容积的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液（g/V）中匀浆后加入等量90%（g/V）苯酚水溶液（内含0.1%8-羟基喹啉）在2℃振荡提取30min。

　　酵母tRNA的提取：

100g酵母（湿重）加入200ml水，300ml90%苯酚水溶液，振荡2h,4℃冰箱中过液，使之提取完全。

　　以上介绍了用冷酚法提取各种RNA的一些实例，近来还有皂土酚法（即除苯酚外还加入皂土吸附蛋白质）提取RNA，据报道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。

但应用苯酚法提取核酸时，须注意市售苯酚常含有少量重金属和杂质，可能导致核酸降解，使用时，一般需要减压重蒸。

（2）DNA的提取：

DNA主要存在于细胞核中，天然状态的DNA绝大多数是以脱氧核糖核蛋白形式存在。

人细胞中提取DNA时，一般先获得脱氧核糖核蛋白，再将蛋白质除去，从中分离DNA。

常用的方法是以1mol/L氯化钠溶液抽提，得到的脱氧核糖核蛋白溶液与含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振荡，除去蛋白质。

或者在组织细胞破碎后以低浓度0.14mol/L氯化钠溶液（也可用0.1mol/L氯化钠加0.05mol/L柠檬酸代替）反复洗涤除去核糖核蛋白，再以1mol/L氯化钠提取脱氧核糖核蛋白，提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白质。

两种方法比较，后一种方法使核酸降解可能少一些。

以稀盐溶液提取DNA时，加入适量去污剂更有助于蛋白质与DNA的分离。

　　应用苯酚法也可以提取DNA而且不用经过脱氧核糖核蛋白这一步骤，例如大鼠肝匀浆在6%对氨基水杨酸盐溶液内，加入同体积90%苯酚水溶液，室温下提取1h，再经进一步提纯可获得98%～99%纯度的DNA。

苯酚法也是目前提取DNA最常用的方法之一。

　　3．活性多肽及递质的提取大体上与蛋白质的提取方法相似，可参照进行。

经典神经递质如去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺等均可化学合成，无需用很多精力去提取。

　　（四）抗原的分离与纯化

　　从细胞中提取出来的生物大分子是不纯净的，必须进一步分离纯化才能获得纯品。

在生物大分子制备工作中，分离纯化是比较复杂和重要的一个环节。

对于异类的物质，如提纯蛋白质和酶时混杂着核酸，提纯核酸时混杂着蛋白质或多糖，一般可用专一性酶水解、有机溶剂抽提、选择性分部沉淀等方法处理，小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互相转化被分离或最后用透析方法除去。

而对同类物质，如酶和杂蛋白，RNA和DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间的分离，情况则复杂得多，主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超速离心法、柱层析法等。

其中盐析法、等电点法、结晶法用于蛋白、酶的提纯较多；有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯较多；柱层析法、梯度离心法在蛋白质和核酸的提纯工作中应用均十分广泛。

本节　侧重对蛋白质、酶和核酸分离纯化中与溶解度有关的一些方法作一简要叙述。

　　1．蛋白质分离纯化的一些方法

（1）盐析法

　　①原理：

盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。

其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。

这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。

但盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。

盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

　　②盐的选择：

蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱和溶解度为4.1mol/L,即767g/L;0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，不容易引起蛋白质变性。

应用硫酸铵时，对蛋白氮的测定有干扰，缓冲能力比较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以上溶解度太低。

其他的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。

　　硫酸铵浓溶液的pH在4.5～5.5之间，市售的硫酸铵常含有少量游离硫酸，pH值往往降至4.5以下，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节　。

　　③硫酸铵饱和度计算法及加入方式：

在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度定为100%。

用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3种。

一是当蛋白质溶液体积不大，所需调整的浓度不高时，可加入饱和硫酸铵溶液；饱和硫酸铵配制方法可加入过量的硫酸铵，热至50～60℃保温数分钟，趁热滤去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天，有固体析出时即达100%饱和度。

盐析所需饱和度可按下式计算：

　　式中V及V0分别代表所需饱和度硫酸铵溶液及原溶液的体积，S2及S1分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。

严格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，但这由体积改变所造成的误差一般小于2%。

故可忽略不计。

另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时，可直接加入固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：

　　式中X是将1升饱和度为S1的溶液提高到饱和度为S2时所需硫酸铵的重量（g），G及A为常数，与温度有关。

G在0℃时为707，20℃时为0.29。

为方便起见，在室温及℃时所需硫酸铵的饱和度可直接查表2-1、表2-2求出。

表2－1　室温下由S1提高到S2时每升加固体硫酸铵的克数

　0.100.200.250.300.350.400.450.500.550.600.650.700.750.800.850.900.951.00

055113114175209242278312350390430474519560608657708760

0.10　5767118149182215250287325365405448494530585634685

0.20　　295990121154188225260298337379420465512559610

0.25　　　296091123157192228265304345386430475521571

0.30　　　　306193125160195232270310351394439485533

0.35　　　　　306294128163199235275315358403449495

0.40　　　　　　316396131166205240280322365410458

0.45　　　　　　　316498133169206245286330373420

0.50　　　　　　　　3263100135172211250292335380

0.55　　　　　　　　　3366101138176214255298344

0.60　　　　　　　　　　3367103140179219261305

0.65　　　　　　　　　　　3469105143182224267

0.70　　　　　　　　　　　　3470108146187228

0.75　　　　　　　　　　　　　3572110149170

0.80　　　　　　　　　　　　　　3673112152

0.85　　　　　　　　　　　　　　　3775114

0.90　　　　　　　　　　　　　　　　3776

0.95　　　　　　　　　　　　　　　　　38

　　④盐析时注意的几个问题

　　1）盐的饱和度：

盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。

分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀。

例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质，饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出；饱和度增至28%～33%时，优球蛋白析出；饱和度再增至33%～50%时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%以上时，白蛋白析出。

用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，从牛胰中酸性提取分离可得到九种以上蛋白质及酶。

　　2）pH值：

在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出，因此，盐析时除个别情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。

　　3）蛋白质浓度：

在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限愈低，如血清球蛋白的溶度从0.5%增到3.0%时，需用中性盐的饱和度的最低极限从29%递减至24%。

某一蛋白质欲进行两次盐析时，第1次由于浓度较稀，盐析分段范围较宽，第2次则逐渐收窄，例如用硫酸铵盐析胆碱酯酶时，第1次硫酸铵饱和度为35%至60%，第2次为40%至60%。

蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利，但浓度过高也容易引起其他杂蛋白的共沉作用，因此，必须选择适当浓度，尽可能避免共沉作用的干扰。

表2-20℃下由S1提高到S2时每100ml加固体硫酸铵的克数

溶液的原始饱和度（%）饱和度在0℃时所达到硫酸铵饱和度（%）

20253035404550556065707580859095100

在100毫升中欲加固体硫酸铵的克数

010.613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.7

57.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2

105.38.110.913.916.920.023.326.630.133.737.441.245.249.353.658.162.7

152.65.46.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.2

2002.75.58.311.314.317.520.724.127.631.234.938.742.746.951.255.7

25　02.75.68.411.514.617.921.124.528.031.735.539.543.647.852.2

30　　02.85.68.611.714.818.121.424.928.532.336.240.244.548.8

35　　　02.85.78.711.815.118.421.825.429.1

32.936.941.045.3

40　　　　02.95.88.912.015.318.722.225.829.633.537.641.8

45　　　　　02.95.99.012.315.619.022.626.330.234.238.3

50　　　　　　03.06.09.212.515.919.423.026.830.834.8

55　　　　　　　03.06.19.312.716.119.123.527.331.3

60　　　　　　　　03.16.29.512.916.420.123.927.9

65　　　　　　　　　03.16.39.713.216.820.521.4

70　　　　　　　　　　03.26.59.913.417.120.9

75　　　　　　　　　　　03.26.610.113.717.4

80