核糖体DNA ITS序列分析在药用植物研究中的应用.docx

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核糖体DNAITS序列分析在药用植物研究中的应用

核糖体DNAITS序列分析在药用植物研究中的应用

【摘要】药用植物核rDNA是高度重复的串联序列，由于同步进化的力量，大多数物种中这些重复单位间已发生纯合或接近纯合。

把核rDNA的内转录间隔区分为ITS1和ITS2两部分。

由于ITS序列变异较快，能够提供较丰富的变异位点和信息位点，已在药用植物鉴别、道地性研究、栽培与野生药用植物遗传差异分析、较低分类阶元的系统发育和分类研究中发挥重要作用。

【关键词】核糖体DNAITS区药用植物

Abstract：

NuclearrDNAinthemedicinalplantsisatandemsequenceofhighlyrepeatableunitswhichbecomehomogenizedornearlyhomogenizedinmostspecies.TheinternaltranscribedspacersofnuclearrDNAwasdividedintoITS1andITS2by　rDNA.Asmutatequickly,ITSsequencesarecapableofprovidingmanyvariablesitesandinformativesites,whichplaysmoreandmoreimportantrolesintheauthenticationsofmedicinalherbs,studiesonthegenuineness,geneticvariationanalysisbetweencultivatedandwildmedicineplants,systematicdevelopmentandclassificationresearchesonthelowertaxonofthemedicinalplants.

Keywords：

NuclearrDNA;ITSsequence;Medicinalplants

人们对药用植物的研究有着悠久的历史。

随着植物遗传学规律的发现与应用，植物大量次生代谢产物的分离与结果鉴定及其对系统学意义的探讨，进一步加深了人们对药用植物的认识。

现代分子生物学技术的迅速发展，使以形态组织学、解剖学等客观指标为划分依据的传统分类学得到了补充，为药用植物系统与进化研究提供了丰富而翔实的资料，为解决分类学、系统发育、物种形成与进化等方面的难题提供了极为有力的技术途径［1］。

中药用于疾病防治已有几千年的历史，但由于中药现代品质监控技术不足，常常出现药材混淆代用、故意伪制的现象，严重影响中药的声誉，甚至危及人身安全，建立健全完善的中药品质检测技术体系迫在眉睫。

目前，越来越多的研究者将ITS应用于药用植物的鉴别，为揭示药用植物的遗传差异和鉴定中药材品种的道地性提供了新的方法和手段［2］。

本文着重对核糖体DNAITS序列分析在药用植物的鉴定、道地性研究、栽培与野生药用植物遗传差异分析及药用植物科以下等级系统与进化研究中的应用进行了综述。

118S-26SrRNA基因的基本结构

目前，核基因组序列在药用植物鉴定和品质研究中的应用主要集中在编码核糖体RNA基因nrDNA重复区内。

高等植物细胞核中nrDNA是高等植物中的rRNA基因（rDNA）是高度重复的串联序列单位，18S，和26SrDNA联结在一起，作为一个转录单位。

18S-26SrDNA在植物中有一至数个位点［3］，拷贝数可达500～40000，18S-26SrDNA基本结构由18SrDNA，26SrDNA，rDNA和位于三者之间的基因内转录间隔区（ITS）组成，其中ITS区由被rDNA所分隔的ITS1和ITS2两个片段组成［4］。

其转录物（transcript）不加入成熟核糖体，只是部分地对nrDNA的成熟起作用。

目前，国内外学者已利用nrDNA中的ITS片段序列作为分子标记，在药用植物鉴定和品质研究方面开展了许多有益的工作。

l8S-26S核rDNAITS区在核基因组中高度重复，而且通过不等交换和基因转换，这些重复单位间已经发生了位点内和位点间的同步进化，即不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致，且所受选择压力较小，碱基替换速率较快，进化速度快，加上片段长度变异很小，ITS1和ITS2的长度均不足300bp，在绝大多数被子植物中不足700bp，非常适合进行各种分子操作［5］。

屈良鸽等通过对不同生物类群的ITS序列（自生物学数据库）的比较得出：

被子植物大多数科属其ITS序列的种间差异值为％～％，属间差异值为％～％，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。

另外，ITS在一些起源古老或世代较长的植物类群（如木本竹子）中的变异较低，也为研究那些间隔区进化速度很慢的古老类群间的关系和长世代类群内较高阶元的系统重建提供了可能性［6］。

2ITS区测序的技术流程及系统学分析

目前研究者对ITS序列分析的具体流程大体相同，主要包括总DNA提取、PCR扩增、、测序、排序等步骤。

　总DNA的提取采用CTAB法或在此基础上略加改良，从新鲜叶片、鲜茎、甚至保存数年的蜡叶标本中提取总DNA。

在野外，可先用硅胶干燥法保存材料，然后带回实验室提取总DNA。

所提取DNA的纯度是影响测序准确性的关键因素。

　PCR扩增、产物纯化及测序选择合适的引物对ITS区进行扩增，然后经琼脂糖电泳检测、回收、纯化。

对PCR产物进行纯化是直接测序的关键，可用离心透析法、透析袋法等。

也可先对PCR产物进行克隆，然后测一个或者多个序列。

Baldwin［7］曾指出，在被子植物系统发育分析中，是测定ITS区PCR克隆，还是直接测定PCR全部产物的序列更好，尚处于争论之中。

常用的测序仪有：

PE公司的ABI3l0，ABI377自动测序仪、LKBDNA测序仪等。

　排序用手工或计算机软件如CLUSTALV、CLUSTALX、CLUSTALW、DNASTAR程序等对所测得的序列进行排序，然后根据空位（gap）情况对排序结果进行适当调整。

ITS1和ITS2的范围可根据GeneBank上已发表的植物18S、和26SrDNA序列以及近缘类群的ITS1、ITS2序列确定。

　系统学分析对已排好的序列进行变异位点（variablesite）和信息位点（informativesite）数目的统计，然后进行系统学分析，只有信息位点才能用于系统学分支分析。

常用的分析软件有PAUP分析软件、PHYIIP3软件包、MEGA等。

对转换（transition）和颠换（transversion）进行加权和对于将gap作为缺失（missing）或新性状（newstate）得到的简约树树形大致相同，但自展数值（bootstrap）不同。

最常用的分支分析法有简约法（parsimonymethod）、邻接法（neighbor-joiningdistancemethod）、最大似然法（maximumlikelihoodmethod）等。

3rDNAITS序列分析在药用植物鉴定中的应用

资源调查表明，我国中草药约有万余种，其中药用植物约占85％，对它们进行明确的鉴别是非常重要的。

中药材的准确鉴定是中药研究和实现中药现代化的基础。

由于我国药用植物种类繁多，药材来源复杂，在药材使用上存在互混、互代、以假充真等及同名异物、同物异名现象，因而影响了用药的安全性和有效性。

应用形态学、组织学和化学成分来鉴定比较困难，通过比较分析ITS区序列，可以很容易地鉴别其真伪［8］。

中药南五味子为华中五味子的干燥果实。

绿叶五味子的化学成分与南五味子有所不同，但果实外形相似，使市场上南五味子药材真伪难辨。

高建平等［9］通过比较采自湖南、四川、陕西、河南、山西、浙江等的12个自然居群的华中五味子和绿叶五味子rDNAITS区的DNA序列的差异及其规律性，得出rDNAITS区为鉴别中药南五味子与混淆品绿叶五味子的一种良好的分子标记。

柴胡是一种多来源药材，在我国的使用已有两千多年的历史。

柴胡具有和解表里、疏散退热、疏肝解郁、升阳举气之功效。

用于治疗感冒发热、口苦耳聋、头痛目眩等症。

目前，在中国报道的柴胡属植物有42种，17变种，7变型。

谢晖等［10］和武莹等［11］的研究均发现：

ITS序列可以作为柴胡类药材鉴定的依据。

此外，Wen等［12］对人参属12种植物的ITS区和进行了序列分析和有效鉴别，发现西洋参与东亚种人参、竹节参、三七具有更近的亲缘关系。

Ngan等［13］以保守的植物序列作引物，对ITS区进行了扩增，并籍以鉴定人参属6种药用植物。

蒋继宏等［14］研究苏皖产大戟属内6种药用植物的ITS区，其结果与来自形态学的研究结果相吻合，从而得出ITS区可用于大戟属植物种间及真伪品鉴别。

郝明干等［15］通过ITS的序列比较，将白花蛇舌草与外形上与其相似的纤花耳草、伞房花耳草和松叶耳草区别开来。

刘忠权等［16］收集目前市场上出现的白花蛇舌草及伪品共9种，通过对其ITS2区的序列的分析，将白花蛇舌草及伪品区分开来。

金成庸等［17］为研究韩茵陈和白莲蒿是否为同一植物，同时对来源于两个不同国家的3种茵陈的rDNAITS序列进行遗传差异的探讨，认为用rDNA的ITS序列分析法鉴别茵陈类药材，方法简便、准确。

彭雪梅等［18］通过对罗布麻及其易混品的DNA分子鉴定，可以将罗布麻同其混淆品大白叶麻和区分开来。

丁平等［19］比较巴戟天与常见混伪品之间的rDNAITS区碱基序列的差异及其规律，得出ITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法。

4rDNAITS序列分析在药用植物科以下等级系统与进化研究中的应用价值

ITS区序列分析已成为在分子水平上探讨科、亚科、族内关系十分有效的手段，在植物系统发育与分类的研究中起了重要作用。

　科内系统与进化刘艳玲等［20］基于核糖体DNAITS区序列探讨了睡莲科植物7属11种的系统发育的关系，结果表明，①莲属Nelumbo可从睡莲科中独立出来成立莲科Nelumbonaceae和莲目Nelumbonales；②萍蓬草属仍应置于睡莲科中；③水盾草属Cabomba和莼菜属Brasenia聚成一小支并构成姐妹群，说明这两属之间亲缘关系较近；④睡莲属和芡实属Euryale、王莲属Victoria聚成一小支并构成姐妹群，说明三者亲缘关系较近，仍应置于睡莲科中。

此外，nrDNAITS序列分析用于槭树科、菖蒲科、柽柳科、金缕梅亚科、君子科风车子亚科、金缕梅科壳菜果亚科等科的系统发育研究中取得了很好的结果。

　属内系统与进化关系密切的物种间ITS长度接近，而序列有一定程度的变异，因此，该片段特别适合于属，尤其是近缘属间关系等低级分类群的研究［21］。

Kita和Ito［22］利用ITS序列对产于东亚的乌头亚属一些二倍体种与四倍体种进行了系统发育分析。

Utelli等［23］为了解释产于欧洲的黄花牛扁复合体的系统关系，测定了产于欧洲与高加索山脉的所有牛扁亚属的种与产于欧洲的乌头亚属的种的nrDNAITS序列及cpDNA的psbA-tmH序列，并运用简约性方法，进行了系统发育分析。

张富民等［24］对乌头属Aconitum个类群的nrDNAITS序列进行了简约法与邻接法分析，结果表明，紫乌头复合体不是一个单系类群，可能经历了3次不同的起源。

这三项研究显示，ITS序列数据均为乌头属植物系统发育关系研究提供了有意义的信息。

赵国平等［25］测定中日当归属21份材料药用植物的ITS区序列，经Phylip软件分析，建立系统发育树，聚类结果与当归属药用植物功效差异基本吻合。

汪红等［26］研究中药丹参ITS片段遗传多样性，发现该序列在丹参种内保守，在属间有较大的差异，与外类群的差异最大。

蒋继宏等［27］研究苏皖产大戟属内6种药用植物的ITS长度的变异，聚类所得系统进化树与形态学的研究结果相吻合，为探讨大戟属植物的系统演化关系和大戟属植物鉴定提供DNA分子证据。

闫坤等［28］对地黄属6个物种进行了核糖体内转录间隔区序列分析，结合形态学研究认为，地黄属为单系起源，天目地黄与湖北地黄有较近的亲缘关系；高地黄和裂叶地黄应为同一物种；地黄与茄叶地黄是属内进化水平最高的类群。

　种内系统与进化由于nrDNA的ITS区域具较多的碱基变异信息，在长度上具较好的保守性，因而近十几年来被广泛地用于生药的种间鉴别［29］。

曹晖等［30］还认为可将ITS区用于种下一级分类群亲缘关系研究。

罗玉明等［31］分析紫苏属各变种间（紫苏、白苏、鸡冠苏和耳齿紫苏等）rDNAITS区的序列以及存在的单核苷酸多态性（SNP）现象，设计出位点特异性PCR引物，用于紫苏属各变种间的分子标记鉴别。

吴玲等［32］利用ITS序列对石蒜属13个种（含变种）的亲缘关系进行分析，表明石蒜属13个种可分为三大类，比较系统进化树和核型分析，推导出稻草石蒜、乳白石蒜和短蕊石蒜为变种。

5应用rDNAITS序列探讨药用植物道地性

中药的品质关系到临床用药的安全有效，发展道地药材是实现中药现代化的关键。

药材道地性主要是指药材中有效成分的地域差异性，品质优良是道地药材的表现型。

药材道地性研究是药学研究的热点之一，主要包括两个方面：

一是研究形成药材道地性的重要原因；二是如何鉴别药材市场上的道地性药材。

药用植物道地性的形成与其代谢过程中的酶系统发生的“道地性”变化有密切联系，但这种变化受其居群的遗传特性和生态环境的影响。

目前，关于药用植物品质的研究多限于形态、化学药效学方面，但道地性药材与非道地性药材在形态和生药性状等特征上的差别常不明显，这给应用传统方法鉴别道地药材带来了困难［33］。

DNA分子作为遗传信息的载体，不受材料的生长环境及发育时期等的影响，通过rDNAITS序列分析，找到不同样本间在DNA水平上的遗传差异，对药材地理分布和分化变异进行评判与划分，不仅使从分子水平上来揭示药材道地性形成的原因成为可能，而且使道地药材的鉴定更为便利、准确。

如果同时结合药效成分分析，对于道地药材的品质评价能起到指导性作用［34］。

为研究莲的种质资源道地性的鉴定、为其质量控制和莲的GAP实施提供科学依据，林珊等［35］和唐先华等［36］分别从分子水平上比较了不同地区莲的差异，结果表明不同地区莲的ITS区序列有一定的差异，莲样品的ITS区序列即其ITS及的序列分析资料可为莲的品种鉴别及分类提供新的手段。

半夏为天南星科半夏属植物，其干燥块茎为我国传统大宗药材。

张君毅等［37］对来自我国半夏主要的16个居群18个样本rDNA中的ITS区序列进行分析，得出半夏rDNA变异与其地理分布相关。

马玉花等［38］对l5个来自不同地区杜仲品系rDNA的ITS序列分析，为分布于我国同地区杜仲的分类鉴别提供分子生物学依据。

王淑美等［39］探讨不同产地牛膝的ITS的序列变异，得出牛膝与川牛膝及土牛膝碱基序列有明显差异，不同产地、不同栽培品种牛膝碱基序列无差异。

目前，应用DNA序列分析方法探讨药用植物道地性的研究虽然才刚起步，但是将来自不同居群药材的化学成分和其DNA序列分析相结合则可以为药用植物道地性的研究提供

由于生态环境的改变等因素，生物的遗传特性及其生药品质在一定程度上发生了变化，产地和栽培对生药品质及药性产生巨大影响。

在人类回归自然的今天，在野生种比栽培种品质更好的观念指导下加之经济利益的驱动，以栽培种冒充野生种，给药材流通造成混乱，ITS区在其识别方面有其良好的应用前景［40］。

马小军等通过RAPD指纹比较研究发现，野山参与栽培参之间存在较大的遗传变异。

为了搞清野生人参与栽培人参之间的遗传变异程度，马小军等［41］对4个野山参的ITS和2个野山参的ITS进行了测序分析，并对照栽培人参和西洋参L.的ITS基因序列，研究野生人参与栽培人参之间以及两者与近缘种西洋参之间的遗传关系。

结果表明，黑龙江和朝鲜栽培参的种探与抚橙的野山参较近，而湖北栽培参（U41681）可能从引自其它野山参居群。

ITS的遗传信息有助于人参种质资源分析，能为栽培参起源提供一定证据。

保曙琳等［42］对野生菱和栽培菱种rDNAITS片段进行分析，发现尽管菱属各居群间rDNAITS的差异百分率较小，其亲缘关系较近，但根据ITS序列的特征可以很好地鉴别野生菱、栽培菱，菱属植物有可能都起源于同一种野生类居群。

戴波等［43］对不同倍性及其非整倍体韭和野韭核糖体DNAITS进行了分析，得出虽然韭经历了长期的人工选择和自然选择，但与野韭的分化仍然较小。

李建强等［44］对山毛榉科水青冈属6种、1亚种、1栽培变种的ITS区片段进行了测序和分析，发现各类群间ITS区序列差异较小，显示属内现存物种的分化时间不是太长。

　　7前景与展望

随着DNA测序技术的快速发展，rDNAITS序列分析已经应用到了中药的基原鉴定、道地性研究等多个领域，在生药鉴别方面也已进行了许多开拓性的研究［45］。

虽然DNA序列分析技术操作复杂、成本高，在实际应用中仍存在很大的困难，目前还不能成为一种常用的鉴别手段，但却为从DNA水平上寻找药用植物鉴定和道地药材鉴别的可靠的特异性DNA分子标记提供了有益的启示。

道地药材是指那些来源于特定产区的具有中国特色的名优正品药材，它们在遗传和生态两种因素长期复杂的相互作用下，形成了特有的品种和药性。

但由于道地药材和非道地药材物种来源相似，在形态、药性、化学成分等特征上具有高度的一致性，对道地药材的鉴定很困难［46］。

利用rDNAITS区虽已经取得了一些进展但还缺乏整体、全面的资料，因此应选择一些具有道地性且名贵的中药，如人参、地黄、川贝等，构建其DNA文库，并对其DNA文库进行大量分析，筛选出有用蛋白基因，进而克隆这些基因，建立我国自己的基因储备。

同时进一步对这些药材进行遗传分子标记研究，找出其道地性即药用植物多样性的遗传分子基础。

对同一物种在不同环境下形成的道地性与非道地性进行深入的遗传学研究，阐明其道地性的规律，建立完善的道地性评价的遗传学、分子生物学和天然药物化学指标体系。

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