各种酶活性测定方法.docx
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各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法
第一超氧化物歧化酶SOD测定
超氧物歧化酶（superoxidedismutase,
SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种
清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四哇（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有!
化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生02,可将氮蓝四哇还原为蓝色的甲腺，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2,从而抑制了甲腺的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料；水稻或小麦叶片
（二）仪器设备：
1•高速台式离心机；2.
分光光度计；3.微量进样器；4•荧光灯（反应试管处照度为4000LX）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂1.0.05mol/L磷酸缓冲液（）;
2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：
称
用磷酸缓冲液定容至100ml；pmol/L氮蓝
四哇溶液：
称取用磷酸缓冲液定容至
100mb避光保存；4.100|imol/LEDTA—
N"溶液：
称取一N"用磷酸缓冲液定容至1000ml；5.20pmol/L核黄素溶液：
称取0.0753g核黄素用蒸馅水定容至1000ml避
光保存。
三、实验步骤
1.酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，lml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5mlo取〜2ml于lOOOrpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液。
2.显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：
试剂（酶）用量
（ml）终浓度（比色时）L磷酸缓冲液L
Met溶液L750nmol/LNBT溶液pmol/LlOOpmol/LEDTA—Na2液pmol/L20pimol/L核黄素nmol/L酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馅水总体积混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000LX日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3.SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。
结果计算
已知SOD活性单位以抑制N盯光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活性=（Ack-
AE）xV/（AckXxWxVt）
上式中，SOD比活力=SOD总活性蛋白质
含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：
mg蛋白/g鲜重。
SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法
缩写：
SOD：
超氧化物歧化酶；CAT：
过氧化氢酶；POD：
过氧化物酶；MDA：
丙二醛；PVP：
聚乙烯毗咯烷铜K-30；L-Met：
甲硫氨酸；
NBT：
氮蓝四哇；TBA：
硫代巴比妥酸；TCA：
三氯乙酸；PBS:
磷酸缓冲液
1.SOD的测定方法
加样顺序：
（V=3ml）磷酸缓冲液：
L-Met:
NBT:
EDTA-Na2:
核黄素：
酶液：
蒸馅水:
试剂配制:
（1）LPBS：
（2）130mmol/LL-Met:
1.9399gMet用PBS定容至100ml
（3）750mmol/LNBT:
0.06133g用PBS定容至100ml（避光保存）
（4）lOOumol/LEDTA-Na2:
0.03721g用PBS定容至1000ml
⑸20umol/L核黄素:
0.0753g用蒸水定容至1000ml（避光保存）
注：
（1）对照：
以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管
（2）照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值的测定方法试剂配制:
（1）5%TCA：
5g用蒸馅水定容至500ml
（2）%TBA：
2.5g用TCA定容至500ml
方法:
酶液lml—%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,
10000r/min离心10min—用蒸馅水调零分
另lj测定上清液在532nm>600nm处的吸收
值
的测定方法试剂配制:
（I）L的醋酸缓冲液：
+得到的醋酸缓冲液
AL的HAc溶液）一6ml冰醋酸溶到494ml蒸馆水中
BL的NaAc溶液）一
（2）%愈创木酚溶液一125um愈创木酚溶于50ml50%乙醇中（临用前配制）
（3）%H2O2溶液：
30%H2O2定容至50ml（临用前配制）
方法：
比色杯中依次加入2mlL的醋酸缓冲液一lml%愈创木酚溶液一xml酶液
（5min值为500-800即可）—%H2O2溶液一迅速巅到混匀把A460调零并开始计时一1次/30s,连续读取3min
的测定方法
试剂配制：
（1）50mmol/L的PBS（）
（2）%H2O2—lmlH2O2定容至100ml
方法：
⑴以不加H2O2的50mmol/L的PBS
（）为空白把A240调零
（2）50ul酶液一3ml50mmol/L的PBS（）—%
H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时一lmin
后在240nm下比色，1次/lmin（连续读取
5min）o
2010年06月22日星期二19:
33
1叶绿素含量测定：
80%的丙酮液的配制：
4L丙酮+1L蒸馅
水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80%的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm>645nm>
652nm和470nm下测定光密度，以80%
的丙酮液为空白。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P35〜36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰
Ca=抗氧化酶活性的定：
（2.5g样）
L磷酸缓冲溶液（PBS）（pH=）溶液的配制:
65.5506gNa2HPO412H2O+2.65285g
NaH2PO4-2H2O,定容到4L。
（参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，
P134）o
取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为L磷酸缓冲溶液（pH=）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。
丙二醛（MDA）的测定:
20%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：
称200g
三氯乙酸，用蒸馅水定容到1000mlo（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；%硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：
称
5g硫代巴比妥酸（TBA），用20%三氯乙酸
（TCA）溶液溶解并定容到1000mlo（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠lmol/L溶解）；酶液（对照用的LpH二的磷酸缓冲液代替
酶液）（做三个重复）+3mlTBA一一振荡沸水浴上反应30min冷却（至少
30min）——比色（OD600、OD532、OD450）。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）超氧化物歧化酶（SOD）的测定:
NBT（400ml）混合反应液：
392mlPBS（Phm+0・0206gNBT+0.776g甲硫酸钱+8ml核黄素溶液+EDTA-Na溶液
（lOOmlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。
（另配）100mlPBS溶液加EDTA-Na
测试时:
取3ml反应液+（根）或ml（叶）粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。
过氧化物酶（POD）的测定：
L磷酸缓冲溶液（PBS）（pH=）溶液的配制:
10.9251gNa2HPO4-12H2O+3.042975gNaH2PO4・2H2O,定容到1000mlo
%H2O2溶液的配制：
吸30%H2O2,用LpH二磷酸缓冲溶液（PBS）定容到250mlo
%愈创木酚溶液的配制:
称0・5g愈创木酚,用LpH二磷酸缓冲溶液（PBS）定容到250mlo2ml%H2O2溶液+%愈创木酚溶液+lmlLpH=磷酸缓冲溶液（PBS）+（原来为）酶液（根加酶液）（对照用L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。
将每分钟OD增加定义为1个活力单位。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）比色时加酶液,混合后即刻计时。
脯氨酸的测定
标准曲线的制作:
编号
4
5
6
7
标准脯氨酸的量（ml）
0
H2O（ml）
0
冰乙酸（ml）
2
2
2
2
2
2
2
显色液（ml）
脯氨酸含量（nD
o
1
2
4
6
8
10
酶液（对照用80%乙醇代替）（做三个重
复）+lml冰乙酸+显色液混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520。
可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）
牛血清白蛋白：
配成100|ig/ml和
1000pig/mlo90%乙醇：
90ml乙醇+10ml蒸馆水。
85%（W/V）磷酸：
170ml磷酸+30ml
蒸馅水。
考马斯亮蓝G-250:
称0.2g考马斯亮蓝
G-250溶于100ml90%乙醇中，加入85%
（W/V）磷酸200ml,用蒸馆水定容到2Lo
常温下可保存一个月O标准曲线的制作:
配制0〜lOOpg/ml血清白蛋白血液管号
4
5
6
lOOpg/ml牛血清白蛋白（ml）
0
蒸水量（ml）
0
蛋白质含量（ml）
0
9
1011
12
100pg/ml牛血清白蛋白（ml）
蒸馅水量（ml）
0
蛋白质含量（ml）
0
酶液（做三个重复）+5ml考马斯亮蓝
G-250混匀，放置2min后在595nm
下比色。
过氧化氢酶（CAT）的测定:
%H2O2溶液的配制：
吸5ml30%H2O2,用LpH=磷酸缓冲溶液（PBS）定容到500mlo
1ml%H2O2溶液+H2O+ml酶液，测定240nm处OD降低速度。
将每分钟
OD减少定义为1个活力单位。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》
P121）
抗坏血酸（ASA）的测定：
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125）
5%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：
25g三氯乙酸，用蒸馆水定容到500mlo
10%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：
25g三氯乙酸，用蒸馅水定容到250mlo
150mmol/LNaH2PO4（pH）溶液的配制:
100mlo
44%H3PO4溶液的配制：
250mlo
4%2,2■二联毗腱溶液的配制：
250mlo
3%FeCl3溶液的配制：
100mlo首先标制作准曲线。
Ill
III
粗酶液的提取:
取低温保存的鲜样，称0.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管,加入15m5%三氯乙酸（TCA）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸
（ASA）含量的测定。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125〜126）
测定：
粗酶液+150mmol/LNaH2PO4（pH）溶液+H2O,混匀（振荡），至少30秒后，再依次分别加入：
ml10%三氯乙酸（TCA）溶液+ml44%H3PO4溶液+ml4%2,2■二联毗唳溶液+3%FeCl3溶液，混合后在37°C水浴中保温60min,测定OD525处的值。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125〜126）
谷胱甘肽的测定：
4g新鲜材料+2mlL醋酸汞+2ml30%醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馆水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置lOmin,使之充分沉淀，离心后弃去上清液，沉淀以水（每次10ml）在摇动情况下冲洗2次。
向沉淀中加入10mllmol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌5min后加入lml20%的碘化钾溶液，混匀，离心。
上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。
离心后溶液与第一次离心液合并。
向得到的溶液中加入淀粉液，用lmmol/LKIO3滴定，直至出现不消失的蓝色为止。
lml1mmol/L的KIO3相当于谷胱甘肽。
（参考《现代植物生理学实验指南》，中国科学院上海植物生理研究所编）O天冬酰胺合成酶（AS）的测定：
天冬酰胺转氨酶（AspAT）的测定：
3硝酸还原酶（NR）的测定采用离体法：
（lg样）（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P27〜29）
亚硝酸钠标准溶液（lHg/ml）：
称NaNO20・9857g,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000mlo
mol/L的磷酸缓冲溶液：
30.0905g
Na2HPO4-12H2O+2.4965g
NaH2PO4-2H2O,加蒸馅水定容到1000mlo3mol/LHCI：
125ml浓盐酸加蒸馅水定容到500mlo1%磺胺溶液：
5.0g磺胺溶于500ml3mol/LHCI中。
%a•荼胺溶液：
l.Oga-^胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馅水定容到500ml,贮于棕色瓶中。
LKNO3溶液：
5.055gKNO3溶于500mlnmol/L的磷酸缓冲溶液。
L的磷酸缓冲溶液：
Na2HPO4-12H2O8.8640g+NaH2PO4-2H2O0.0570g,加蒸憾
水定容到lLo提取缓冲液：
1.211g半胱氨酸+0.372g
EDTA,溶于ILmol/L的磷酸缓冲溶液。
2mg/mlNADH溶液：
0.5gNADH溶于
250mlmol/L的磷酸缓冲溶液（临用前
配制）。
首先标制作准曲线:
取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,
III
即配成o〜pg的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在3（rc保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色。
以亚硝态氮（憾）为横坐标（X），光密度值为纵坐标（y）绘标准曲线或建立回归方程。
各试剂加入顺序
管号
1
2
4
5
6
7
亚硝酸钠标准液（ml）
0
蒸馅水（ml）
1%磺胺溶液（ml）
%每管含NO2-（pg）lg材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4°C>4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶（NR）的测定。
S3
+LKNO3溶液+溶液后混匀（对照不加NADH溶液，而以LpH磷酸缓冲液代替），在25°C水浴中保温30mino保温结束后立即加入lml磺胺溶液终止酶反应，再加lml%a■蔡胺溶液，显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度。
根据回归方程计算。
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