各种酶活性测定方法.docx
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各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法
第一超氧化物歧化酶SOD测定
超氧物歧化酶(superoxidedismutase,
SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种
清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四哇(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有!
化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生02,可将氮蓝四哇还原为蓝色的甲腺,后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2,从而抑制了甲腺的形成。
于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料;水稻或小麦叶片
(二)仪器设备:
1•高速台式离心机;2.
分光光度计;3.微量进样器;4•荧光灯(反应试管处照度为4000LX);5.试管或指形管数支。
(三)试剂1.0.05mol/L磷酸缓冲液();
2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:
称
用磷酸缓冲液定容至100ml;pmol/L氮蓝
四哇溶液:
称取用磷酸缓冲液定容至
100mb避光保存;4.100|imol/LEDTA—
N"溶液:
称取一N"用磷酸缓冲液定容至1000ml;5.20pmol/L核黄素溶液:
称取0.0753g核黄素用蒸馅水定容至1000ml避
光保存。
三、实验步骤
1.酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,lml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5mlo取〜2ml于lOOOrpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液。
2.显色反应取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液:
试剂(酶)用量
(ml)终浓度(比色时)L磷酸缓冲液L
Met溶液L750nmol/LNBT溶液pmol/LlOOpmol/LEDTA—Na2液pmol/L20pimol/L核黄素nmol/L酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馅水总体积混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000LX日光下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。
3.SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度。
结果计算
已知SOD活性单位以抑制N盯光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。
SOD总活性=(Ack-
AE)xV/(AckXxWxVt)
上式中,SOD比活力=SOD总活性蛋白质
含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积(ml)Vt测定时样品用量(ml)W样鲜重(g)蛋白质含量单位为:
mg蛋白/g鲜重。
SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法
缩写:
SOD:
超氧化物歧化酶;CAT:
过氧化氢酶;POD:
过氧化物酶;MDA:
丙二醛;PVP:
聚乙烯毗咯烷铜K-30;L-Met:
甲硫氨酸;
NBT:
氮蓝四哇;TBA:
硫代巴比妥酸;TCA:
三氯乙酸;PBS:
磷酸缓冲液
1.SOD的测定方法
加样顺序:
(V=3ml)磷酸缓冲液:
L-Met:
NBT:
EDTA-Na2:
核黄素:
酶液:
蒸馅水:
试剂配制:
(1)LPBS:
(2)130mmol/LL-Met:
1.9399gMet用PBS定容至100ml
(3)750mmol/LNBT:
0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)
(4)lOOumol/LEDTA-Na2:
0.03721g用PBS定容至1000ml
⑸20umol/L核黄素:
0.0753g用蒸水定容至1000ml(避光保存)
注:
(1)对照:
以加缓冲液、不照光为空白;照光的为最大还原管
(2)照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值的测定方法试剂配制:
(1)5%TCA:
5g用蒸馅水定容至500ml
(2)%TBA:
2.5g用TCA定容至500ml
方法:
酶液lml—%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,
10000r/min离心10min—用蒸馅水调零分
另lj测定上清液在532nm>600nm处的吸收
值
的测定方法试剂配制:
(I)L的醋酸缓冲液:
+得到的醋酸缓冲液
AL的HAc溶液)一6ml冰醋酸溶到494ml蒸馆水中
BL的NaAc溶液)一
(2)%愈创木酚溶液一125um愈创木酚溶于50ml50%乙醇中(临用前配制)
(3)%H2O2溶液:
30%H2O2定容至50ml(临用前配制)
方法:
比色杯中依次加入2mlL的醋酸缓冲液一lml%愈创木酚溶液一xml酶液
(5min值为500-800即可)—%H2O2溶液一迅速巅到混匀把A460调零并开始计时一1次/30s,连续读取3min
的测定方法
试剂配制:
(1)50mmol/L的PBS()
(2)%H2O2—lmlH2O2定容至100ml
方法:
⑴以不加H2O2的50mmol/L的PBS
()为空白把A240调零
(2)50ul酶液一3ml50mmol/L的PBS()—%
H2O2—迅速颠倒混匀,开始计时一lmin
后在240nm下比色,1次/lmin(连续读取
5min)o
2010年06月22日星期二19:
33
1叶绿素含量测定:
80%的丙酮液的配制:
4L丙酮+1L蒸馅
水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管(做三个重复),加入25ml浓度为80%的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm>645nm>
652nm和470nm下测定光密度,以80%
的丙酮液为空白。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35〜36)也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰
Ca=抗氧化酶活性的定:
(2.5g样)
L磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=)溶液的配制:
65.5506gNa2HPO412H2O+2.65285g
NaH2PO4-2H2O,定容到4L。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,
P134)o
取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管,加入20ml浓度为L磷酸缓冲溶液(pH=)(最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活),研磨(用磨碎机磨),8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液。
丙二醛(MDA)的测定:
20%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:
称200g
三氯乙酸,用蒸馅水定容到1000mlo(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124);%硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制:
称
5g硫代巴比妥酸(TBA),用20%三氯乙酸
(TCA)溶液溶解并定容到1000mlo(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124)(先加少量的氢氧化钠lmol/L溶解);酶液(对照用的LpH二的磷酸缓冲液代替
酶液)(做三个重复)+3mlTBA一一振荡沸水浴上反应30min冷却(至少
30min)——比色(OD600、OD532、OD450)。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124)超氧化物歧化酶(SOD)的测定:
NBT(400ml)混合反应液:
392mlPBS(Phm+0・0206gNBT+0.776g甲硫酸钱+8ml核黄素溶液+EDTA-Na溶液
(lOOmlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素)。
(另配)100mlPBS溶液加EDTA-Na
测试时:
取3ml反应液+(根)或ml(叶)粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度。
过氧化物酶(POD)的测定:
L磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=)溶液的配制:
10.9251gNa2HPO4-12H2O+3.042975gNaH2PO4・2H2O,定容到1000mlo
%H2O2溶液的配制:
吸30%H2O2,用LpH二磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250mlo
%愈创木酚溶液的配制:
称0・5g愈创木酚,用LpH二磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250mlo2ml%H2O2溶液+%愈创木酚溶液+lmlLpH=磷酸缓冲溶液(PBS)+(原来为)酶液(根加酶液)(对照用L磷酸缓冲溶液代替酶液)(做三个重复),记录470nm处OD降低速度。
将每分钟OD增加定义为1个活力单位。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121)比色时加酶液,混合后即刻计时。
脯氨酸的测定
标准曲线的制作:
编号
4
5
6
7
标准脯氨酸的量(ml)
0
H2O(ml)
0
冰乙酸(ml)
2
2
2
2
2
2
2
显色液(ml)
脯氨酸含量(nD
o
1
2
4
6
8
10
酶液(对照用80%乙醇代替)(做三个重
复)+lml冰乙酸+显色液混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520。
可溶性蛋白的测定(参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》)
牛血清白蛋白:
配成100|ig/ml和
1000pig/mlo90%乙醇:
90ml乙醇+10ml蒸馆水。
85%(W/V)磷酸:
170ml磷酸+30ml
蒸馅水。
考马斯亮蓝G-250:
称0.2g考马斯亮蓝
G-250溶于100ml90%乙醇中,加入85%
(W/V)磷酸200ml,用蒸馆水定容到2Lo
常温下可保存一个月O标准曲线的制作:
配制0〜lOOpg/ml血清白蛋白血液管号
4
5
6
lOOpg/ml牛血清白蛋白(ml)
0
蒸水量(ml)
0
蛋白质含量(ml)
0
9
1011
12
100pg/ml牛血清白蛋白(ml)
蒸馅水量(ml)
0
蛋白质含量(ml)
0
酶液(做三个重复)+5ml考马斯亮蓝
G-250混匀,放置2min后在595nm
下比色。
过氧化氢酶(CAT)的测定:
%H2O2溶液的配制:
吸5ml30%H2O2,用LpH=磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500mlo
1ml%H2O2溶液+H2O+ml酶液,测定240nm处OD降低速度。
将每分钟
OD减少定义为1个活力单位。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》
P121)
抗坏血酸(ASA)的测定:
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125)
5%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:
25g三氯乙酸,用蒸馆水定容到500mlo
10%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:
25g三氯乙酸,用蒸馅水定容到250mlo
150mmol/LNaH2PO4(pH)溶液的配制:
100mlo
44%H3PO4溶液的配制:
250mlo
4%2,2■二联毗腱溶液的配制:
250mlo
3%FeCl3溶液的配制:
100mlo首先标制作准曲线。
Ill
III
粗酶液的提取:
取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管,加入15m5%三氯乙酸(TCA)溶液(最好是较冷的三氯乙酸(TCA)溶液,防止研磨时温度过高使酶失活),研磨(用磨碎机磨),15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸
(ASA)含量的测定。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125〜126)
测定:
粗酶液+150mmol/LNaH2PO4(pH)溶液+H2O,混匀(振荡),至少30秒后,再依次分别加入:
ml10%三氯乙酸(TCA)溶液+ml44%H3PO4溶液+ml4%2,2■二联毗唳溶液+3%FeCl3溶液,混合后在37°C水浴中保温60min,测定OD525处的值。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125〜126)
谷胱甘肽的测定:
4g新鲜材料+2mlL醋酸汞+2ml30%醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馆水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置lOmin,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水(每次10ml)在摇动情况下冲洗2次。
向沉淀中加入10mllmol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入lml20%的碘化钾溶液,混匀,离心。
上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。
离心后溶液与第一次离心液合并。
向得到的溶液中加入淀粉液,用lmmol/LKIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止。
lml1mmol/L的KIO3相当于谷胱甘肽。
(参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院上海植物生理研究所编)O天冬酰胺合成酶(AS)的测定:
天冬酰胺转氨酶(AspAT)的测定:
3硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法:
(lg样)(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27〜29)
亚硝酸钠标准溶液(lHg/ml):
称NaNO20・9857g,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000mlo
mol/L的磷酸缓冲溶液:
30.0905g
Na2HPO4-12H2O+2.4965g
NaH2PO4-2H2O,加蒸馅水定容到1000mlo3mol/LHCI:
125ml浓盐酸加蒸馅水定容到500mlo1%磺胺溶液:
5.0g磺胺溶于500ml3mol/LHCI中。
%a•荼胺溶液:
l.Oga-^胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馅水定容到500ml,贮于棕色瓶中。
LKNO3溶液:
5.055gKNO3溶于500mlnmol/L的磷酸缓冲溶液。
L的磷酸缓冲溶液:
Na2HPO4-12H2O8.8640g+NaH2PO4-2H2O0.0570g,加蒸憾
水定容到lLo提取缓冲液:
1.211g半胱氨酸+0.372g
EDTA,溶于ILmol/L的磷酸缓冲溶液。
2mg/mlNADH溶液:
0.5gNADH溶于
250mlmol/L的磷酸缓冲溶液(临用前
配制)。
首先标制作准曲线:
取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,
III
即配成o〜pg的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在3(rc保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色。
以亚硝态氮(憾)为横坐标(X),光密度值为纵坐标(y)绘标准曲线或建立回归方程。
各试剂加入顺序
管号
1
2
4
5
6
7
亚硝酸钠标准液(ml)
0
蒸馅水(ml)
1%磺胺溶液(ml)
%每管含NO2-(pg)lg材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4°C>4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶(NR)的测定。
S3
+LKNO3溶液+溶液后混匀(对照不加NADH溶液,而以LpH磷酸缓冲液代替),在25°C水浴中保温30mino保温结束后立即加入lml磺胺溶液终止酶反应,再加lml%a■蔡胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度。
根据回归方程计算。