各种酶活性测定方法.docx

1、各种酶活性测定方法各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定超氧物歧化酶（superoxidedismutase ,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据 超氧物歧化酶抑制氮蓝四哇（NBT）在光 下的还原作用来确定酶活性大小。在有!化物质存在下，核黄素可被光还原，被还 原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而 产生02,可将氮蓝四哇还原为蓝色的甲 腺，后者在560nm处有最大吸收。而SOD 可清除O2,从而抑制了甲腺的形成。于是 光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶 活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计 算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻

2、或小麦叶片（二）仪器设备：1高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4荧光灯（反 应试管处照度为4000LX）； 5.试管或指形管 数支。（三）试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液（）;2. 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称用磷酸缓冲液定容至100ml； pmol/L氮蓝四哇溶液：称取用磷酸缓冲液定容至100mb 避光保存；4. 100|imol/L EDTAN溶液：称取一N用磷酸缓冲液定容至 1000ml； 5. 20pmol/L核黄素溶液：称取 0.0753g核黄素用蒸馅水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1.酶液提取 取一定部位的植物叶片（视 需要定，去叶脉）

3、0.5g于预冷的研钵中， lml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成 浆,加缓冲液使终体积为5mlo取2ml 于lOOOrpm下离心20min,上清液即为 SOD粗提液。2.显色反应 取5ml指形管（要求透明度 好）4支，2支为测定管，另2支为对照 管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）L磷酸缓冲液LMet 溶液 L 750nmol/L NBT 溶液 pmol/L lOOpmol/L EDTANa2 液 pmol/L 20pimol/L 核黄素nmol/L酶液支对照管以缓冲液代 替酶液蒸馅水总体积混匀后将1支对照管 置暗处，其它各管于4000LX日光下反应 20min (要求各

4、管受光情况一致，温度高 时间缩短，低时延长)。3.SOD活性测定与计算 至反应结束后， 以不照光的对照管做空白，分别测定其它 各管的吸光度。结果计算已知SOD活性单位以抑制N盯光化还原 的50%为一个酶活性单位表示，按下式计 算SOD活性。SOD总活性=(Ack-AE)xV/(AckXxWxVt)上式中，SOD比活力= SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位 示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的 吸光度V样品液总体积(ml) Vt测定时样 品用量(ml) W样鲜重(g)蛋白质含量 单位为：mg蛋白/g鲜重。SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试 剂盒法缩写：SOD：超

5、氧化物歧化酶；CAT：过 氧化氢酶；POD：过氧化物酶；MDA： 丙二醛；PVP：聚乙烯毗咯烷铜K-30； L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四哇；TBA：硫代巴比妥酸；TCA： 三氯乙酸；PBS:磷酸缓冲液1.SOD的测定方法加样顺序：(V=3ml)磷酸缓冲液：L-Met:NBT:EDTA-Na2:核黄素：酶液：蒸馅水:试剂配制:(1)LPBS：(2)130mmol/L L-Met: 1.9399g Met 用 PBS 定容至100ml(3)750mmol/L NBT: 0.06133g 用 PBS 定容 至100ml(避光保存)(4)lOOumol/L EDTA-Na2: 0.03721g

6、 用 PBS 定容至1000ml20umol/L核黄素:0.0753g用蒸水定 容至1000ml(避光保存)注：(1)对照：以加缓冲液、不照光为空 白；照光的为最大还原管(2)照光后至显蓝色要立即避光放置、 迅速测定A560值 的测定方法 试剂配制:(1) 5% TCA： 5g用蒸馅水定容至500ml（2）% TBA： 2.5g 用 TCA 定容至 500ml方法:酶液lml%TBA和5%TCA混合后在100 度水浴煮沸15min迅速冷却,10000r/min离心10min用蒸馅水调零分另lj测定上清液在532nm 600nm处的吸收值的测定方法 试剂配制:（I） L的醋酸缓冲液：+得到的醋酸

7、缓冲 液AL的HAc溶液）一6ml冰醋酸溶到 494ml蒸馆水中BL的NaAc溶液）一（2）%愈创木酚 溶液一125um愈创木酚溶于50ml 50%乙 醇中（临用前配制）（3）%H2O2 溶液：30% H2O2 定容至 50ml （临用前配制）方法：比色杯中依次加入2mlL的醋酸缓 冲液一lml %愈创木酚溶液一xml酶液（5min 值为 500-800 即可）%H2O2 溶 液一迅速巅到混匀把A460调零并开始计 时一 1次/30s,连续读取3min的测定方法试剂配制：（1） 50mmol/L 的 PBS （） （2） % H2O2lml H2O2定容至100ml方法：以不加H2O2的50m

8、mol/L的PBS（）为空白把A240调零（2） 50ul 酶液一3ml 50mmol/L 的 PBS（） %H2O2迅速颠倒混匀，开始计时一lmin后在240nm下比色，1次/lmin（连续读取5min）o2010年06月22日 星期二19:331叶绿素含量测定：80%的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馅水。称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做 三个重复），加入25ml浓度为80%的丙酮 液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出, 稀释4倍后分别在波长663nm 645nm652nm和470nm下测定光密度，以80%的丙酮液为空白。（参考陈建勋，王晓峰 主编的植物生理学实验指导，P353

9、6） 也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm 处有最大吸收峰Ca=抗氧化酶活性的定：（2.5g样）L磷酸缓冲溶液（PBS）（pH=）溶液的配制:65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285gNaH2PO4-2H2O,定容到4L。（参考陈建勋, 王晓峰主编的植物生理学实验指导，P134)o取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或 根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度 为L磷酸缓冲溶液（pH=）（最好是较冷的 磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶 失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min 的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为 粗酶液。丙二醛（MDA）的测定:

10、20%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馅水定容到1000mlo （参 考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实 验指导,P124）； %硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA），用20%三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml o （参考 陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验 指导,P124）（先加少量的氢氧化钠lmol/L 溶解）； 酶液（对照用的L pH二的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA一一振 荡 沸水浴上反应30min 冷却（至少30min)比色(OD600、OD532、OD450)。(参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理 学实验

11、指导，P124) 超氧化物歧化酶(SOD)的测定:NBT(400ml)混合反应液： 392mlPBS(Phm+00206g NBT+ 0.776g 甲硫 酸钱+8ml核黄素溶液+ EDTA-Na溶液(lOOmlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄 素)。(另配)100ml PBS 溶液加 EDTA-Na测试时:取3ml反应液+(根)或ml(叶)粗酶 液,于光照培养箱中6-10分钟，OD650 下测定吸光度。过氧化物酶(POD)的测定：L磷酸缓冲溶液(PBS) (pH=)溶液的配制: 10.9251g Na2HPO4-12H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容到 1000

12、ml o%H2O2溶液的配制：吸30%H2O2,用L pH二磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml o%愈创木酚溶液的配制:称05g愈创木酚, 用L pH二磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml o 2ml %H2O2溶液+ %愈创木酚溶液+ lmlLpH=磷酸缓冲溶液（PBS） + （原来为） 酶液（根加酶液）（对照用L磷酸缓冲溶液 代替酶液）（做三个重复），记录470nm处 OD降低速度。将每分钟OD增加定义为1 个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编 的植物生理学实验指导P121） 比色时加酶液,混合后即刻计时。脯氨酸的测定标准曲线的制作: 编号4567标准脯氨酸的量（ml）0H2O （m

13、l）0冰乙酸（ml）2222222显色液（ml）脯氨酸含量（nDo1246810酶液（对照用80%乙醇代替）（做三个重复）+ lml冰乙酸+显色液 混匀, 沸水浴15min,冷却后测OD520。可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安， 董新纯编的植物生理学实验指导）牛血清白蛋白：配成100|ig/ml和1000pig/mlo 90%乙醇：90ml乙醇+10ml蒸馆水。85%（W/V）磷酸：170ml 磷酸 + 30ml蒸馅水。考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸200ml,用蒸馆水定容到2Lo常温下可保存一个月O 标准曲线的制

14、作: 配制0lOOpg/ml血清白蛋白血液 管号456lOOpg/ml牛血清白蛋白(ml)0蒸水量(ml)0蛋白质含量（ml）0910 1112100pg/ml牛血清白蛋白(ml)蒸馅水量(ml)0蛋白质含量(ml)0酶液(做三个重复)+ 5ml考马斯亮蓝G-250 混匀，放置2min后在595nm下比色。过氧化氢酶（CAT）的测定:%H2O2溶液的配制：吸5ml30%H2O2,用 L pH=磷酸缓冲溶液（PBS）定容到500ml o1 ml %H2O2 溶液 + H2O + ml 酶液， 测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少定义为1个活力单位。（参考陈建 勋，王晓峰主编的植物生理学

15、实验指导P121)抗坏血酸（ASA）的测定：（参考陈建勋， 王晓峰主编的植物生理学实验指 导,P125）5%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g 三氯乙酸，用蒸馆水定容到500mlo10%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g 三氯乙酸，用蒸馅水定容到250ml o150mmol/L NaH2PO4 （pH ）溶液的配制: 100ml o44% H3PO4溶液的配制：250mlo4% 2,2二联毗腱溶液的配制：250mlo3% FeCl3溶液的配制：100mlo 首先标制作准曲线。IllIII粗酶液的提取:取低温保存的鲜样，称0.5g 左右的叶片（或根）放在50ml的离心管, 加入15m 5%三

16、氯乙酸（TCA）溶液（最好 是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研 磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎 机磨），15000r/min的冷冻离心机下离心 10分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸（ASA）含量的测定。（参考陈建勋，王晓 峰主编的植物生理学实验指导P125 126）测定：粗酶液 + 150mmol/L NaH2PO4 （pH ）溶液+ H2O,混匀（振荡），至 少30秒后，再依次分别加入：ml 10%三 氯乙酸（TCA）溶液 + ml 44% H3PO4 溶液+ ml 4% 2,2二联毗唳溶液+ 3% FeCl3溶液，混合后在37C水浴中保 温60min,测定OD525处的值。（参

17、考陈 建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指 导P125126）谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料+2mlL醋酸汞+2ml 30%醋 酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸 馆水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置 lOmin,使之充分沉淀，离心后弃去上清 液，沉淀以水（每次10ml）在摇动情况下 冲洗2次。向沉淀中加入10ml lmol/L盐 酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌 5min后加入lml 20%的碘化钾溶液，混 匀，离心。上清液转入供滴定用的100ml 玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml水 冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。 向得到的溶液中加入淀粉液，用lmmol/L KIO3滴定，直至出现

18、不消失的蓝色为止。 lml 1 mmol/L的KIO3相当于谷胱甘肽。（参考现代植物生理学实验指南，中 国科学院上海植物生理研究所编）O 天冬酰胺合成酶（AS）的测定：天冬酰胺转氨酶（AspAT）的测定：3硝酸还原酶（NR）的测定采用离体法：（lg 样）（参考陈建勋，王晓峰主编的植物 生理学实验指导，P2729）亚硝酸钠标准溶液（lHg/ml）：称NaNO2 09857g,定容到1000ml,再吸5ml定容到 1000ml omol/L的磷酸缓冲溶液：30.0905gNa2HPO4-12H2O + 2.4965gNaH2PO4-2H2O,加蒸馅水定容到1000mlo 3mol/L HCI： 1

19、25ml浓盐酸加蒸馅水定容到 500ml o 1%磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCI 中。% a荼胺溶液：l.Og a-胺溶于125ml冰 醋酸后用蒸馅水定容到500ml,贮于棕色 瓶中。L KNO3 溶液：5.055g KNO3 溶于 500mln mol/L的磷酸缓冲溶液。L的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4-12H2O 8.8640g + NaH2PO4-2H2O 0.0570g,加蒸憾水定容到lLo 提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372gEDTA,溶于IL mol/L的磷酸缓冲溶液。2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH 溶于250ml mol/

20、L的磷酸缓冲溶液（临用前配制）。首先标制作准曲线: 取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,III即配成opg的系列标准亚硝态氮溶液。 摇匀后在3(rc保温箱或恒温水浴中保温 30min,然后在540nm波长下比色。以亚 硝态氮(憾)为横坐标(X)，光密度值为 纵坐标(y)绘标准曲线或建立回归方程。 各试剂加入顺序管号124567亚硝酸钠标准液(ml)0蒸馅水(ml)1%磺胺溶液(ml)% 4000r/min下离心 15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸 还原酶(NR)的测定。S3+ L KNO3溶液+溶液后混匀(对照不加 NADH溶液，而以L pH磷酸缓冲液代 替)，在25C水浴中保温30mino保温结 束后立即加入lml磺胺溶液终止酶反应， 再加lml % a蔡胺溶液，显色反应15min 后于4000r/min下离心5min,取上清液在 540nm下比色测定吸光度。根据回归方程 计算。