1、各种酶活性测定方法各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定超氧物歧化酶(superoxidedismutase ,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据 超氧物歧化酶抑制氮蓝四哇(NBT)在光 下的还原作用来确定酶活性大小。在有!化物质存在下,核黄素可被光还原,被还 原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而 产生02,可将氮蓝四哇还原为蓝色的甲 腺,后者在560nm处有最大吸收。而SOD 可清除O2,从而抑制了甲腺的形成。于是 光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶 活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计 算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料;水稻
2、或小麦叶片(二)仪器设备:1高速台式离心机;2.分光光度计;3.微量进样器;4荧光灯(反 应试管处照度为4000LX); 5.试管或指形管 数支。(三)试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液();2. 130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:称用磷酸缓冲液定容至100ml; pmol/L氮蓝四哇溶液:称取用磷酸缓冲液定容至100mb 避光保存;4. 100|imol/L EDTAN溶液:称取一N用磷酸缓冲液定容至 1000ml; 5. 20pmol/L核黄素溶液:称取 0.0753g核黄素用蒸馅水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1.酶液提取 取一定部位的植物叶片(视 需要定,去叶脉)
3、0.5g于预冷的研钵中, lml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成 浆,加缓冲液使终体积为5mlo取2ml 于lOOOrpm下离心20min,上清液即为 SOD粗提液。2.显色反应 取5ml指形管(要求透明度 好)4支,2支为测定管,另2支为对照 管,按下列加入各溶液:试剂(酶)用量(ml)终浓度(比色时)L磷酸缓冲液LMet 溶液 L 750nmol/L NBT 溶液 pmol/L lOOpmol/L EDTANa2 液 pmol/L 20pimol/L 核黄素nmol/L酶液支对照管以缓冲液代 替酶液蒸馅水总体积混匀后将1支对照管 置暗处,其它各管于4000LX日光下反应 20min (要求各
4、管受光情况一致,温度高 时间缩短,低时延长)。3.SOD活性测定与计算 至反应结束后, 以不照光的对照管做空白,分别测定其它 各管的吸光度。结果计算已知SOD活性单位以抑制N盯光化还原 的50%为一个酶活性单位表示,按下式计 算SOD活性。SOD总活性=(Ack-AE)xV/(AckXxWxVt)上式中,SOD比活力= SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位 示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的 吸光度V样品液总体积(ml) Vt测定时样 品用量(ml) W样鲜重(g)蛋白质含量 单位为:mg蛋白/g鲜重。SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试 剂盒法缩写:SOD:超
5、氧化物歧化酶;CAT:过 氧化氢酶;POD:过氧化物酶;MDA: 丙二醛;PVP:聚乙烯毗咯烷铜K-30; L-Met:甲硫氨酸;NBT:氮蓝四哇;TBA:硫代巴比妥酸;TCA: 三氯乙酸;PBS:磷酸缓冲液1.SOD的测定方法加样顺序:(V=3ml)磷酸缓冲液:L-Met:NBT:EDTA-Na2:核黄素:酶液:蒸馅水:试剂配制:(1)LPBS:(2)130mmol/L L-Met: 1.9399g Met 用 PBS 定容至100ml(3)750mmol/L NBT: 0.06133g 用 PBS 定容 至100ml(避光保存)(4)lOOumol/L EDTA-Na2: 0.03721g
6、 用 PBS 定容至1000ml20umol/L核黄素:0.0753g用蒸水定 容至1000ml(避光保存)注:(1)对照:以加缓冲液、不照光为空 白;照光的为最大还原管(2)照光后至显蓝色要立即避光放置、 迅速测定A560值 的测定方法 试剂配制:(1) 5% TCA: 5g用蒸馅水定容至500ml(2)% TBA: 2.5g 用 TCA 定容至 500ml方法:酶液lml%TBA和5%TCA混合后在100 度水浴煮沸15min迅速冷却,10000r/min离心10min用蒸馅水调零分另lj测定上清液在532nm 600nm处的吸收值的测定方法 试剂配制:(I) L的醋酸缓冲液:+得到的醋酸
7、缓冲 液AL的HAc溶液)一6ml冰醋酸溶到 494ml蒸馆水中BL的NaAc溶液)一(2)%愈创木酚 溶液一125um愈创木酚溶于50ml 50%乙 醇中(临用前配制)(3)%H2O2 溶液:30% H2O2 定容至 50ml (临用前配制)方法:比色杯中依次加入2mlL的醋酸缓 冲液一lml %愈创木酚溶液一xml酶液(5min 值为 500-800 即可)%H2O2 溶 液一迅速巅到混匀把A460调零并开始计 时一 1次/30s,连续读取3min的测定方法试剂配制:(1) 50mmol/L 的 PBS () (2) % H2O2lml H2O2定容至100ml方法:以不加H2O2的50m
8、mol/L的PBS()为空白把A240调零(2) 50ul 酶液一3ml 50mmol/L 的 PBS() %H2O2迅速颠倒混匀,开始计时一lmin后在240nm下比色,1次/lmin(连续读取5min)o2010年06月22日 星期二19:331叶绿素含量测定:80%的丙酮液的配制:4L丙酮+ 1L蒸馅水。称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管(做 三个重复),加入25ml浓度为80%的丙酮 液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出, 稀释4倍后分别在波长663nm 645nm652nm和470nm下测定光密度,以80%的丙酮液为空白。(参考陈建勋,王晓峰 主编的植物生理学实验指导,P353
9、6) 也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm 处有最大吸收峰Ca=抗氧化酶活性的定:(2.5g样)L磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=)溶液的配制:65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285gNaH2PO4-2H2O,定容到4L。(参考陈建勋, 王晓峰主编的植物生理学实验指导,P134)o取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片(或 根)放在50ml的离心管,加入20ml浓度 为L磷酸缓冲溶液(pH=)(最好是较冷的 磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶 失活),研磨(用磨碎机磨),8000r/min 的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为 粗酶液。丙二醛(MDA)的测定:
10、20%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:称200g三氯乙酸,用蒸馅水定容到1000mlo (参 考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实 验指导,P124); %硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制:称5g硫代巴比妥酸(TBA),用20%三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容到1000ml o (参考 陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验 指导,P124)(先加少量的氢氧化钠lmol/L 溶解); 酶液(对照用的L pH二的磷酸缓冲液代替酶液)(做三个重复)+ 3mlTBA一一振 荡 沸水浴上反应30min 冷却(至少30min)比色(OD600、OD532、OD450)。(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理 学实验
11、指导,P124) 超氧化物歧化酶(SOD)的测定:NBT(400ml)混合反应液: 392mlPBS(Phm+00206g NBT+ 0.776g 甲硫 酸钱+8ml核黄素溶液+ EDTA-Na溶液(lOOmlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄 素)。(另配)100ml PBS 溶液加 EDTA-Na测试时:取3ml反应液+(根)或ml(叶)粗酶 液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650 下测定吸光度。过氧化物酶(POD)的测定:L磷酸缓冲溶液(PBS) (pH=)溶液的配制: 10.9251g Na2HPO4-12H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容到 1000
12、ml o%H2O2溶液的配制:吸30%H2O2,用L pH二磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml o%愈创木酚溶液的配制:称05g愈创木酚, 用L pH二磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml o 2ml %H2O2溶液+ %愈创木酚溶液+ lmlLpH=磷酸缓冲溶液(PBS) + (原来为) 酶液(根加酶液)(对照用L磷酸缓冲溶液 代替酶液)(做三个重复),记录470nm处 OD降低速度。将每分钟OD增加定义为1 个活力单位。(参考陈建勋,王晓峰主编 的植物生理学实验指导P121) 比色时加酶液,混合后即刻计时。脯氨酸的测定标准曲线的制作: 编号4567标准脯氨酸的量(ml)0H2O (m
13、l)0冰乙酸(ml)2222222显色液(ml)脯氨酸含量(nDo1246810酶液(对照用80%乙醇代替)(做三个重复)+ lml冰乙酸+显色液 混匀, 沸水浴15min,冷却后测OD520。可溶性蛋白的测定(参考赵志杰,史国安, 董新纯编的植物生理学实验指导)牛血清白蛋白:配成100|ig/ml和1000pig/mlo 90%乙醇:90ml乙醇+10ml蒸馆水。85%(W/V)磷酸:170ml 磷酸 + 30ml蒸馅水。考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸200ml,用蒸馆水定容到2Lo常温下可保存一个月O 标准曲线的制
14、作: 配制0lOOpg/ml血清白蛋白血液 管号456lOOpg/ml牛血清白蛋白(ml)0蒸水量(ml)0蛋白质含量(ml)0910 1112100pg/ml牛血清白蛋白(ml)蒸馅水量(ml)0蛋白质含量(ml)0酶液(做三个重复)+ 5ml考马斯亮蓝G-250 混匀,放置2min后在595nm下比色。过氧化氢酶(CAT)的测定:%H2O2溶液的配制:吸5ml30%H2O2,用 L pH=磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml o1 ml %H2O2 溶液 + H2O + ml 酶液, 测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少定义为1个活力单位。(参考陈建 勋,王晓峰主编的植物生理学
15、实验指导P121)抗坏血酸(ASA)的测定:(参考陈建勋, 王晓峰主编的植物生理学实验指 导,P125)5%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:25g 三氯乙酸,用蒸馆水定容到500mlo10%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:25g 三氯乙酸,用蒸馅水定容到250ml o150mmol/L NaH2PO4 (pH )溶液的配制: 100ml o44% H3PO4溶液的配制:250mlo4% 2,2二联毗腱溶液的配制:250mlo3% FeCl3溶液的配制:100mlo 首先标制作准曲线。IllIII粗酶液的提取:取低温保存的鲜样,称0.5g 左右的叶片(或根)放在50ml的离心管, 加入15m 5%三
16、氯乙酸(TCA)溶液(最好 是较冷的三氯乙酸(TCA)溶液,防止研 磨时温度过高使酶失活),研磨(用磨碎 机磨),15000r/min的冷冻离心机下离心 10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸(ASA)含量的测定。(参考陈建勋,王晓 峰主编的植物生理学实验指导P125 126)测定:粗酶液 + 150mmol/L NaH2PO4 (pH )溶液+ H2O,混匀(振荡),至 少30秒后,再依次分别加入:ml 10%三 氯乙酸(TCA)溶液 + ml 44% H3PO4 溶液+ ml 4% 2,2二联毗唳溶液+ 3% FeCl3溶液,混合后在37C水浴中保 温60min,测定OD525处的值。(参
17、考陈 建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指 导P125126)谷胱甘肽的测定:4g新鲜材料+2mlL醋酸汞+2ml 30%醋 酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸 馆水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置 lOmin,使之充分沉淀,离心后弃去上清 液,沉淀以水(每次10ml)在摇动情况下 冲洗2次。向沉淀中加入10ml lmol/L盐 酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌 5min后加入lml 20%的碘化钾溶液,混 匀,离心。上清液转入供滴定用的100ml 玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水 冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。 向得到的溶液中加入淀粉液,用lmmol/L KIO3滴定,直至出现
18、不消失的蓝色为止。 lml 1 mmol/L的KIO3相当于谷胱甘肽。(参考现代植物生理学实验指南,中 国科学院上海植物生理研究所编)O 天冬酰胺合成酶(AS)的测定:天冬酰胺转氨酶(AspAT)的测定:3硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法:(lg 样)(参考陈建勋,王晓峰主编的植物 生理学实验指导,P2729)亚硝酸钠标准溶液(lHg/ml):称NaNO2 09857g,定容到1000ml,再吸5ml定容到 1000ml omol/L的磷酸缓冲溶液:30.0905gNa2HPO4-12H2O + 2.4965gNaH2PO4-2H2O,加蒸馅水定容到1000mlo 3mol/L HCI: 1
19、25ml浓盐酸加蒸馅水定容到 500ml o 1%磺胺溶液:5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCI 中。% a荼胺溶液:l.Og a-胺溶于125ml冰 醋酸后用蒸馅水定容到500ml,贮于棕色 瓶中。L KNO3 溶液:5.055g KNO3 溶于 500mln mol/L的磷酸缓冲溶液。L的磷酸缓冲溶液:Na2HPO4-12H2O 8.8640g + NaH2PO4-2H2O 0.0570g,加蒸憾水定容到lLo 提取缓冲液:1.211g半胱氨酸+ 0.372gEDTA,溶于IL mol/L的磷酸缓冲溶液。2mg/ml NADH 溶液:0.5g NADH 溶于250ml mol/
20、L的磷酸缓冲溶液(临用前配制)。首先标制作准曲线: 取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,III即配成opg的系列标准亚硝态氮溶液。 摇匀后在3(rc保温箱或恒温水浴中保温 30min,然后在540nm波长下比色。以亚 硝态氮(憾)为横坐标(X),光密度值为 纵坐标(y)绘标准曲线或建立回归方程。 各试剂加入顺序管号124567亚硝酸钠标准液(ml)0蒸馅水(ml)1%磺胺溶液(ml)% 4000r/min下离心 15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸 还原酶(NR)的测定。S3+ L KNO3溶液+溶液后混匀(对照不加 NADH溶液,而以L pH磷酸缓冲液代 替),在25C水浴中保温30mino保温结 束后立即加入lml磺胺溶液终止酶反应, 再加lml % a蔡胺溶液,显色反应15min 后于4000r/min下离心5min,取上清液在 540nm下比色测定吸光度。根据回归方程 计算。
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