医学微生物学实验报告.docx

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医学微生物学实验报告

微生物实验报告

题目

脓汁和粪便标本中病原菌的检测

成绩

年级专业

实验者

学号

组号

小组成员

指导老师

一、实验目的

1.了解细菌生长的基本营养条件以及培养基的种类。

2.掌握培养基制备的原则和一般方法。

3.掌握无菌操作技术。

4.掌握病原菌的分离与培养方法。

5.掌握油镜的正确使用。

6.掌握细菌涂片标本的制备以及革兰氏染色法。

7.熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。

8.掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。

9.掌握纸片扩散法检测药物敏感性原理及应用。

10.掌握玻片凝集试验的原理方法、方法、结果观察与判断。

二、实验器材

1．药品与试剂：

营养琼脂粉、营养肉汤粉、半固体琼脂粉、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、普通营养琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、斜面培养基管、液体培养基管、半固体培养基管、结晶紫染液（第1液）、卢戈氏碘液（第2液）、95%酒精（第3液）、稀释石炭酸复红（第4液）、香柏油、二甲苯、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管、兔血浆、生理盐水、诊断血清、Muller-Hinton琼脂平板、青霉素滤纸片、链霉素滤纸片、庆大霉素滤纸片

2.器材：

1500W电炉、天平、称量纸、药勺、三角烧瓶、量筒、试管、刻度吸管、洗耳球、棉塞、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、试管筐、尺、平皿、酒精灯、电炉、接种环、接种针、染色架、吸水纸、擦镜纸、打火机、笔、显微镜、小砂轮、载玻片、镊子、试管刷、冰箱、恒温培养箱

三、方法与步骤

1、培养基的制备：

培养基

称量干粉培养基（g）

水量（ml）

煮沸（次）

分装（ml）

备注

营养琼脂

11.4

300

2瓶，500ml锥形瓶，平板

营养琼脂

2.9

75

3

5

15支，中试管，斜面

营养肉汤

1.1

50

1

1

15支小试管，液体

半固体琼脂

1.7

60

3

3

15支，小试管，高层

干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到髙压蒸汽灭菌室→灭菌（用于倒平板的培养基不用加热溶解，摇匀即可）

2、细菌的分离培养

平板划线分离法

甲→脓汁标本→营养琼脂平板（黄色）乙→脓汁标本→营养琼脂平板（黄色）

丙一粪便标本一伊红美蓝平板（紫色）丁一粪便标本一伊红美蓝平板（紫色）

方法：

（1）右手拿接种环（如握笔式），烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种环杆部分亦要迅速通过火焰2~3次，以杀灭其表面细菌；

（2）左手握住盛有标本的试管的下端，右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出试管棉塞并挟住之，将管口迅速通过火焰三次灭菌；（3）立即将已灭冷却的接种环伸入试管内，沾取标本（或菌液）一环，试管口火焰灭菌后塞好棉塞;（4）左手斜持平板，略开盖，在酒精灯火焰左前方约5~6cm处，将接种环上的菌液涂抹于平板表面的边缘部分；（5）烧灼接种环，冷却后，从原涂抹部分开始，连续平行划线，每次只划平板的1/4~1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在平板其余部分划线，每次划线要与前次划线重叠1-3条，共计3^次（区）；（6）接种完毕，将接种环烧灼灭菌后方可放下；（7）将培养皿倒置，37°C培养34小时后，观察结果。

3、细菌的纯培养

斜面接种分工

甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面

丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→EMB平板→粉红菌落→1支斜面

方法：

接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记：

组号、颜色→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。

4、细菌的形态学检查

涂片→干燥→固定→染色

（1）涂片→干燥→固定

甲→黄色，紫黑。

乙→白色，粉红。

丙→黄色，紫黑。

丁→白色，粉红。

方法：

涂片：

①接种环取盐水3ulX2滴，水滴间距小于2cm;②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混勻，涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。

→干燥→固定：

手持载玻片→端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2〜3秒钟。

（2）革兰染色

涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干，镜检。

油镜使用方法：

10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:

3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。

5、液体培养基接种（肉汤接种）

甲→黄色，乙→白色，

丙→紫黑，丁→粉红。

方法：

（1）接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；

（2）在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。

退出接种环，烧灼灭菌；（3）标记：

组号，颜色

6、细菌的生化试验等

a.细菌的糖发酵试验

甲—紫黑菌苔—①葡萄糖乙—紫黑菌苔—②乳糖

丙→粉红菌苔→③葡萄糖丁→粉红菌苔→④乳糖

方法：

①用砂轮在糖发酵管液面上方2〜3cm处切割，然后，向切口外侧分离掰断，管口烧灼灭菌。

②接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。

③退出接种针，烧灼灭菌。

④管口朝向相同，放置在平皿内。

b.抗菌素敏感性试验

纸片扩散法

甲→黄色菌液乙→白色菌液

丙→紫黑菌液丁→粉红菌液

方法：

①先取→环菌液；②沿平板直径拉一条细菌接种线；③再取一环菌液；④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”；⑤然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；⑥旋转平板90度角，二次密集划线；⑦旋转平板90度角，三次密集划线；⑧旋转平板90度角，四次密集划线；⑨设三点，呈等边三角距离；⑩点距离平板边缘约15mm;⑪作标记：

青、先、庆；⑫镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。

c.血浆凝固酶试验

兔血浆+黄色，白色

方法：

①取二滴兔血浆（rabbitplasma）置于洁净的玻片上。

②分别用接种环取白色和黄色菌苔（约2〜3个菌落的菌量）与血浆研磨混合成直径8〜10mm的一层薄菌膜，立即观察结果。

③菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。

d.半固体穿刺接种法

甲→白色乙→金黄色

丙→紫黑丁→粉红

方法：

①接种针斜面取菌，从半固体中心，垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针；②管口、接种针经火焰烧灼灭菌；③标记:

组号,颜色。

7、细菌的血清学试验、结果分析

玻片凝集试验

方法：

（1）取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。

远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul;

（2）用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。

四、结果与讨论

（一）实验结果

1.洗手前后对比：

图1.1甲乙洗手前后图1.2丙丁洗手前后

空气的细菌学检查结果（实验室内，暴露在手机下）：

图1.3空气的细菌学检查结果

CFU/m3＝50000N÷AT=50000×13×（3.14×3.5cm2）×40/m3=1118/m3

2.细菌的分离培养结果：

（1）脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。

菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。

（2）粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落，菌落直径2〜3mm；粉红色菌落淡粉红色，半透明，直径1〜2mm.

（3）从四张平板画线的结果上来看，四张均有不足，得不到特别典型的菌落。

第一二张脓汁的营养琼脂平板，前面两区涂抹太密集，而板的其他部位未充分利用，得不到十分明显的菌落。

第三粪便的平板涂布时，用力过大划破平板，而第四张粪便的平板第一区太稀疏，未充分利用平板，故在培养后未见到数量较少的粉红菌落，原因是初次划线时，力度与划线的密度均未能很好地掌握，动作不熟练，不能连续划线。

图2.1甲，乙→脓汁标本→营养琼脂平板

图2.2丙，丁→粪便标本→伊红美蓝平板

3.细菌的纯培养：

在斜面培养基上得到四种菌体的纯培养标本，从普通平板上挑取的金黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，金黄色或白色。

从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。

菌苔灰白色、表面湿润、光滑、前者不透明，后者透明。

图3.1四种菌落在斜面培养基上生长情况

右左向右依次为金黄，白色，紫黑，粉红菌苔

4.细菌的形态学检查:

图4.1脓汁菌苔（左边为金黄色菌苔，右图为白色菌苔）

图4.2粪便菌苔（左图为紫黑色菌苔，右图为粉红菌苔）

镜下观察：

用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。

结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。

用伊红美蓝平板，从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。

紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。

粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。

显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。

5、液体培养基接种

图5.1液体培养基接种结果从左至右分别为：

（①黄色细菌②白色细菌③紫黑色细菌④粉红色细菌）

6.细菌的生化试验等:

（1）半固体穿刺接种法

图6.1半固体穿刺

结果观察及讨论：

表1.动力试验结果

菌苔半固体实验

紫黑细菌1+

紫黑细菌2+

粉红细菌1-

粉红细菌2-

+：

阳性-：

阴性

1、紫黑细菌1和2细菌自接种部位向四周移动、扩散生长，培养基略微呈毛刷状或云雾状混浊状态，表明其有鞭毛。

结合其他组的结果，我们认为紫黑菌苔应当是动力阳性的。

2、粉红细菌菌苔均沿着直线生长，可看出其无鞭毛。

（2）细菌的糖发酵试验

图6.2糖发酵实验结果图.从左至右分别为：

（①紫黑→葡萄糖②紫黑→乳糖③粉红→葡萄糖④粉红→乳糖）

编号

菌苔

糖发酵管

反应现象

结果描述

符号

甲

紫黑

①

糖发酵管变黄色有气泡

分解X糖产酸又产气

⊕

乙

紫黑

②

糖发酵管变黄色有气泡

分解X糖产酸又产气

⊕

丙

粉红

③

糖发酵管变黄色无气泡

分解X糖产酸不产气

+

丁

粉红

④

糖发酵管仍紫色无气泡

分解X糖不产酸不产气

-

+：

产酸或阳性⊕：

产酸产气-：

阴性

紫黑细菌微型发酵关内液体变黄，产生气泡，气泡的高度分别为10mm和17mm，说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，产酸产气；粉红细菌只分解葡萄糖，不产气，不分解乳糖。

（3）抗菌素敏感试验结果:

图6.3抗菌素敏感试验结果

表3各菌抑菌圈直径（mm）表

菌苔青霉素头孢曲松庆大霉素

金黄色354232

白色282134

紫黑—3027

粉红—3530

表4.药敏试验结果分析

青霉素头孢曲松庆大霉素

金黄色+++

白色±±+

紫黑-++

粉红-++

-