文献综述蛋白质多级结构的表征方式及测定方法讲述.docx
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文献综述蛋白质多级结构的表征方式及测定方法讲述
文献综述
蛋白多级结构的表征及测定方式
摘要研究蛋白质的结构对生命科学有重要意义，因为明确了蛋白质的结构，有助于了解蛋白质的作用，了解蛋白质如何行使其生物功能，认识蛋白质与蛋白质（或其它分子）之间的相互作用，这无论是对于生物学还是对于生物医学和生物药学，都是非常重要的。
蛋白质分子的多级结构可划分为四级，以描述其不同的方面，包括蛋白二级结构、超二级结构和结构域、三级结构、四级结构。
关键词：
二级结构超二级结构和结构域三级结构四级结构表征和测定方式
1蛋白多级结构概述
蛋白质分子是由氨基酸首尾相连缩合而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象，即蛋白质的结构。
1.1蛋白质的二级结构
蛋白质的二级结构（secondarystructure）是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。
蛋白质主链构象的结构单元包括：
α-螺旋（α－helix）、β-片层结构（β－pleatedsheet）或称β-折迭、β-转角（β－turn或β－bend）、无规卷曲（randomcoil）。
α-螺旋有以下几个特点：
①多个肽键平面通过α－碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。
②主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm。
③每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C=O之间形成氢键。
④肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α－螺旋的形成。
β-片层结构有以下几个特点：
①是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角。
氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。
②依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C=O与H形成氢键，使构象稳定。
③两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。
即前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。
β-片层结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。
④平行的β-片层结构中，两个残基的间距为0.65nm；反平行的β-片层结构，则间距为0.7nm。
β-转角结构的特点：
蛋白质分子中，肽链经常会出现180°的回折，在这种回折角处的构象就是β-转角。
无规卷曲的特点：
没有确定规律性的部分肽链构象，肽链中肽键平面不规则排列。
图1蛋白质的二级结构
1.2蛋白质的超二级结构和结构域
超二级结构（supersecondarystructure）是指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体。
目前发现的超二级结构有三种基本形式：
α螺旋组合（αα）；β折叠组合（βββ）和α螺旋β折叠组合（βαβ），其中以βαβ组合最为常见。
结构域（domain）也是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。
在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区别。
一般每个结构域约由100-200个氨基酸残基组成，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。
蛋白质的三维空间结构与其功能紧密相关，而超二级结构正是构成三维结构的基本单元。
从蛋白质一级结构直接预测三维空间结构非常困难，蛋白质二级结构及超二级结构正是两者直接之间的重要桥梁，因此超二级结构的预测有着重要的研究意义。
图2蛋白质的超二级结构
图3结构域
1.3蛋白质的三级结构
蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构（tertiarystructure）。
现也有人认为蛋白质的三级结构是指蛋白质分子主链折叠盘曲形成构象的基础上，分子中的各个侧链所形成一定的构象。
侧链构象主要是形成微区（或称结构域）。
蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力等。
这些次级键可存在于一级结构序号相隔很远的氨基酸残基的R基团之间，因此蛋白质的三级结构主要指氨基酸残基的侧链间的结合。
图4蛋白质的三级结构
1.4蛋白质的四级结构
具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构称为蛋白质的四级结构（quarternarystructure）。
其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基（subunit）。
四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。
图5蛋白质的四级结构
2蛋白多级结构的测定方式
2.1蛋白质二级结构的测定方式
蛋白质的二级结构在在维持蛋白质的生理活性的过程中发挥着十分重要的作用。
近年来，国内外学者利用各种物理和化学方法对其做了大量的工作。
目前，常用的蛋白质二级结构检测方法有X-射线晶体衍射、核磁共振光谱、圆二色光谱、紫外光谱、荧光光谱与红外光谱等[1]。
这些方法各有其优缺点。
2.1.1X-射线晶体衍射法
X-射线晶体衍射[2]是确定蛋白质构象最准确的方法。
虽然其能够提供完整的蛋白质晶体结构信息，但它要求高质量的单晶样品，对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说，得到所需的晶体结构较为困难。
同时，对于某种特定的蛋白来说，结晶过程有可能改变蛋白质的结构，使得两种状态下蛋白质的结构不完全相同。
而且，它只是反映蛋白质的一种静态结构，不能用于测定蛋白质的溶液构象，不容易说明大分子在生理状态下结构与功能的关系。
另外其实验过程复杂、所用时间长也是该技术的不足之处。
马礼敦[3]在文章中却提到X-射线晶体衍射在测定HIV病毒及多种有关蛋白的结构中的应用及其广泛。
1989年已测出HIV-1蛋白酶的晶体结构，属天冬氨酸蛋白酶族，图6左为其带状结构图。
是由2个99个氨基酸肽链构成的二聚体，呈C2对称，并找到每个单体上有一个天冬氨酸活性点。
图6右图为HIV-1蛋白酶局部的原子结构图，画出了它与抑制剂A-74704的氢键结合模式，上中部的叉形分子即为抑制剂。
图6左的上部空穴中的蓝色分子也为抑制剂分子。
图6（左）HIV-1蛋白酶的晶体结构与抑制剂；（右）抑制剂与A-74704与HIV-1蛋白酶之间的氢键结合模式
2.1.2核磁共振光谱法
核磁共振法常规应用于解析化学物质结构和反应性能，尤其是在确定溶液中蛋白和多肽结构方面起着其它物理分析方法不可比拟的作用。
张猛[4]等人在文章中综述了核Overhauser效应（NOE）等确定蛋白或多肽二级结构的方法。
NMR方法可以在很宽的时间尺度上进行蛋白质动力学的研究。
针对大分子量蛋白和信号灵敏度较低的情况下，可以釆用固体核磁共振和位点特异性氨基酸标记的方法进行蛋白质结构、功能和动力学的研究。
石攀[5]在文章中介绍了目前用于核磁共振研究的非天然氨基酸的种类和标记方法，分别介绍了液体和固体核磁在非天然氨基酸标记研究中的应用。
2.1.3圆二色光谱法
毛晓英[6]在文章中采用远紫外圆二色光谱来表征核桃蛋白碱溶酸沉的制备过程中二级结构的变化。
图7核桃蛋白样品的远紫外CD图谱（a核桃脱脂粉；b核桃分离蛋白；c核桃浓缩蛋白）
如图7所示，核桃分离蛋白和浓缩蛋白与核桃脱脂粉的CD图谱负峰峰形基本一致。
核桃脱脂粉具有典型的α-螺旋结构的谱图，在201nm和221nm有2个负的肩峰谱带。
核桃分离蛋白在204nm和229nm有负肩峰。
其负峰位发生了红移。
核桃浓缩蛋白在199nm和221nm有2个负的肩峰谱带。
表1远紫外CD测定核桃蛋白样品的二级结构a
通过软件分析二级结构数据（见表1）可知，核桃脱脂粉主要以α-螺旋结构为主，占80.4%。
核桃分离蛋白和浓缩蛋白的二级结构含量比较相似，主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，分别占35%，32%，其中β-折叠结构有所增加。
由此结果可以看出，核桃蛋白包含了α-螺旋，β-折叠，β-转角，无规则卷曲等4种类型的二级结构，其中以α-螺旋和无规则卷曲较多。
核桃分离蛋白和浓缩蛋白在制备过程中改变了核桃蛋白质的二级结构，其中，在一定程度上破坏了α-螺旋结构，使β-折叠少量增加，同时无规则卷曲和β-转角结构明显增加。
王铮[7]等人利用圆二色光谱检测蛋白质并对蛋白的二级结构进行分析、计算，可以得到对蛋白二级结构影响的各种因素和结果。
对不同蛋白二级结构的圆二色检测结果表明，在检测过程合适的蛋白浓度对结果的稳定性有非常重要的用，对于抗体蛋白来说，浓度为10~50μg/ml的区间内，计算得到的二级结构
比例是基本稳定的，超出该范围，计算结果偏差加大。
图8不同浓度血清白蛋内的圆二色光谱测量结果
如图8所示，为不同浓度血清白蛋内的圆二色光谱测量结果。
图9不同浓度的模型蛋白圆二色光谱图
对不同浓度的模型蛋白圆二色光谱图进行二级结构计算结果如表2所示，从表2可以看出，浓度介于10~100μg/ml时，计算出的蛋白的二级结构波动小。
表2不同浓度模型蛋白的二级结构计算表
对浓度范围1~500μg/ml的模型蛋白进行圆二色扫描，并对得到的谱图进行二级结构计算，结果表明，在蛋白浓度介于10~100μg/ml之间时，谱图光滑，里然圆二色光谱图的强度有变化，但是峰形相似，计算出的蛋白的二级结构波动小，接近预测值。
浓度过大、过小时二级结构计算结果变化较大，拟合因子大，和预测结构偏离大。
2.1.4傅里叶红外光谱法
傅里叶红外光谱法FTIR是近20年来才兴起的新的光谱学技术，与传统的色散型红外光谱仪相比有其独特之处。
FTIR属于分子振动吸收光谱，是化合物鉴定和结构分析的常用手段。
其独特之处，就在于可以测定不同状态、不同浓度及不同环境中的蛋白质和多肽。
因此它是目前研究蛋白质及多肽结构与功能关系强有力的主要手段之一[8]。
戈志成[9]等人采用FTIR法对改性小麦面筋蛋白的二级结构进行了测定。
实验内容主要采用该法（FTIR）对湿热-琥珀酸酐酰化改性谷阮粉进行结构分析。
结果显示：
谷朊粉的二级结构是以β-折叠结构为主，改性后的谷朊粉二级结构有明显变化，琥珀酸酐处理会使部分β-转角结构转化为β-折叠结构，并且使α-螺旋结构减少。
下图是将样品用研钵研磨成均匀粉末，压制成薄片，再用红外光谱仪做全波段扫描（400-4000cm-1），扫描次数128次。
图10
（1）谷朊粉
（2）湿热-酰化处理谷朊粉（3）湿热谷朊粉（4）酰化处理谷朊粉
图10中
（1）-（4）样品分别为原料谷朊粉、湿热-酰化处理谷朊粉、湿热谷朊粉、酰化处理谷朊粉。
经过湿热处理的谷朊粉结构变化比较小，仅有少量的β-转角结构转化为β-折叠。
经过单独琥珀酸酐处理的谷朊粉β-折叠的结构有大幅度的增加，而β-转角α-螺旋结构含量明显减少。
而经过湿热-琥珀酸酐酰化的谷朊粉的α-螺旋结构变化不大，而β-折叠有所增加β-转角相应减少，但是β-折叠增加幅度并没有单独琥珀酸酐处理的谷朊粉的变化幅度大。
拉曼光谱（Raman）、核磁共振谱（NMR）、圆二色谱（CD）、红外光谱（IR）等方法都先后用来研究蚕丝及丝蛋白的构象及其转变机制[10]。
其中，傅立叶变换红外光谱（Fouriertransforminfrared，FTIR）是最常用的手段之一，它是对连续光源干涉图进行傅立叶逆变换所得光谱。
傅立叶红外光谱凭借其对物质分子结构的灵敏性而广泛应用于蛋白质二级
结构和构象转变的研究中。
在丝蛋白的中红外光谱中，呈现酞胺I至酞胺v区域的特征吸收峰，使其能够对丝蛋白的构象，即无规线团、α-螺旋（α-helix）和β-折叠β-sheet）等，进行强有力的表征。
莫春丽[11]在对再生丝蛋白二级结构的表征研究中就采用的是傅里叶红外光谱法。
测定结果如下：
实验主要采用再生丝蛋白水溶液（Regeneratedsilkfibroin，RSF）来制备丝蛋白膜样品。
实验中制备了四种样品并将其命名：
RSF-200-25为25℃下浇铸的厚度约为200μm的厚膜；RSF-200-60为60℃下浇铸的厚度约为200μm的厚膜；RSF-10-25为25℃下浇铸的厚度约为10μm的薄膜，RSF-10-25-M代表RSF-10-25经过70%甲醇（Methanol）水溶液浸泡lh。
试验中采用NieoletNexus470FTIR光谱仪对该四种样品近红外透射测试。
波谱范围为4000-11000cm-1，光谱分辨率为4cm-1，每条谱线由128次扫描叠加。
图11为我们制备的四种样品的OMNI采样全反射红外图谱。
图中的线a对应于60℃下干燥的厚膜RSF-200-60，线b则对应于经过甲醇水溶液处理的薄膜RSF-10-25-M，二者均显现了β-折叠特征峰，即分别位于酰胺I区域的1625crn-1酰胺Ⅱ区域的1530cm-1和酰胺Ⅲ区域的1230cm-1。
这说明了样品RSF-200-60和RSF-10-25-M的二级结构主要为β-折叠。
图11ATRSpectraof（a）RSF-200-60,（b）RSF-10-25-M,（e）RSF-200-25and（d）RSF-10-25.
常温下测量的再生丝蛋白膜的近红外光谱及其导数谱线如图12所示。
丝蛋白肤链分子包含了多个氨基酸重复序列[Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser]n。
由此可以推测近红外光谱中产生的吸收主要来源于O-H、N-H、C-H、C-N和C=O等基团的伸缩振动与变形振动的倍频与合频吸收。
图12NIRSpectrumof（a）RSF-200-25and（b）itssecondderivativecurve
史苏佳[12]等人采用傅里叶变换红外光谱法对磷脂酶D二级结构进行表征。
实验过程大致如下：
取水溶液样品（花生磷脂酶D）2mL，加入ATR中，以相同条件下的磷酸盐缓冲液为背景，采集红外图谱。
以上测定均在室温下进行，扫描范围4000~400cm-1，仪器分辨率为4cm-1，扫描次数32次，每个样品至少检测5次。
图13醋酸盐缓冲液的红外光谱
图14磷酸盐缓冲液的红外光谱
对于PLD（花生磷脂酶D）水溶液来说，利用FTIR表征蛋白质二级结构的数据如下表所示。
表3FTIR表征PLD蛋白质二级结构的结果
样品
方法
二级结构含量（%）
螺旋
折叠
转角
无规卷曲
pH3.27
FTIR
26
19
22
33
pH4.00
30
15
22
33
pH5.85
31
20
20
29
pH7.00
27
20
22
31
pH7.49
32
19
24
25
2.2蛋白质的超二级结构和结构域的测定方式
邹东升[13]在蛋白质超二级结构的预测研究中，对支持向量机的β发夹结构进行了预测试验，之所以选择β-发夹结构，是因为β-发夹是蛋白质中频繁出现的一种超二级结构，是除了基本的α-螺旋和β-折叠外最典型的局部结构域结构，在各类蛋白质结构中都有出现，表现出多样性，对其进行预测能够减少蛋白质结构中可能的折叠数目，对确定蛋白质三级结构有重要的作用。
首先，进行数据采集。
本实验中采用的是ArchDB40数据集和Kumar数据集。
其次，进行β-发夹模式抽取；最后进行模型的预测，本文结合β-β模体序列特点，选取氨基酸组成成份、二肽组成成份和氨基酸组成分布3种不同的ID参数构成特征向量。
2.3蛋白质三级结构的测定方式
邵光亭[14]对基于多特征融合的蛋白质三级结构进行了预测。
进行蛋白质三级结构预测的一般步骤包括：
1．数据集选择
2．通过特征提取方法将蛋白质的氨基酸序列转变成维数固定的特征向量。
3．选择合适的分类模型。
4．通过训练集对分类模型进行训练。
5．对训练好的分类模型进行测试。
6．评价测试结果。
蛋白质结构数据集是蛋白质三级结构预测的基础，选择合理的数据集是做好蛋白质三级结构的第一步。
本次特征融合实验所选取的是同源相似性为40%的1189数据集，在1189数据集中四种蛋白质三级结构的样本数量是比较均衡的。
沈星灿[15]等人采用远紫外圆二色数据辨认蛋白质的三级结构类型。
蛋白质的三级结构模型可分为4类:
（1）全α型，以α-螺旋结构为主，其分量大于40%，而β-折叠的分量小于5%；
（2）全β型，以β-折叠这种结构为主，其分量大于40%，而α-螺旋的分量小于5%；（3）α+β型，α-螺旋及β-折叠分量都大于15%，这两种结构在空间上是分离的，且超过60%的折叠链是反平行排列；（4）α/β型，α-螺旋
和β-折叠含量都大于15%，它们在空间上是相间的，且超过60%的折叠链平行排列。
图15三级结构类型中具有代表性的蛋白质的CD谱
a全α型蛋白：
肌红蛋白（—），细胞色素c（－－－）
bα+β型蛋白：
溶菌酶（—），核糖核酸酶A（－－－）
cα/β型蛋白：
丙糖磷酸异构酶（—），黄素氧化还原酶（－－－），枯草杆菌蛋白酶BPN’（…）
d全β型蛋白：
前血清蛋白（—），B-J蛋白（－－－）
e全β型蛋白：
α-糜蛋白酶（—），大豆胰岛素抑制剂（－－－）
2.4蛋白质四级结构的测定方式
王彤[16]等人采用基于线性降维方法对蛋白质四级结构类型进行预测，本实验中采用的数据集是从Swiss-Prot数据库中抽取出来的。
张振慧[17]等人对基于氨基酸和二肽组成的蛋白质四级结构分类进行研究。
试验基于最近邻居算法，从蛋白质一级序列出发，利用蛋白质序列氨基酸组成、二肽组成以及混合组成方法对蛋白质单聚体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和八聚体进行分类研究。
结果表明：
采用二肽组成编码方法的预测效果最好。
3总结
蛋白质是生物体中重要的生物大分子，是进行生命活动的基础，蛋白质结构与功能之间的关系非常密切。
蛋白质的结构分为一级结构，二级结构，超二级结构和结构域，三级结构和四级结构。
蛋白质的二级结构形式主要有α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲。
三级结构是指蛋白质中各原子的空间排布，原子之间的距离信息等，三级结构是蛋白质具有生物功能活性的基础，具有特定构象的蛋白质行使特定的生理功能。
四级结构是蛋白质各亚基之间的空间排布和亚基接触部位相互作用。
蛋白质功能的多样性与其空间结构密不可分，蛋白质的空间结构是蛋白质功能活性的基础，蛋白质的空间构象发生改变，其活性即会改变或者丧失。
因此，研究蛋白质的多级结构对于我们今后开发和利用蛋白质的多种功能活性来说，会是一个很好的基础。
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