MTT配制原理操作步骤结果分析注意事项.docx

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MTT配制原理操作步骤结果分析注意事项

MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项

D

一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。

此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。

比如：

生长较快的细胞密度可略小。

2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul,这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。

●        注意：

因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

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3.      将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。

下图可做为96孔板的的参考步局。

●      对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。

但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。

另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

4.      5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。

5.      每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

6.      终止培养，准备溶解结晶。

●        溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解

1）       MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。

将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。

有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。

个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。

采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

2）       每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡

10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

●        另一种方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）

1）       MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。

这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。

（该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。

）

2）       放入培养箱中继续孵育4

—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。

通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。

如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。

如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。

个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。

7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

MTT的操作方法

一、MTT是什么

MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：

噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

二、MTT法用来做什么

 简单地说：

是一种检测细胞存活和生长的方法。

MTT主要有两个用途

1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；

2．细胞增殖及细胞活性测定。

三、为何MTT可以用来做上述工作

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

四、实验所需材料

1．MTT溶液的配制通常MTT配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。

市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g

1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。

具休做法：

预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20mlPBS，从中先吸取500-1000ulPBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。

可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。

将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光（避光袋或是黑纸、锡箔纸包住）可长期保存于-20度。

按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。

1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。

注意事项：

l在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

l配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感

lMTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

lMTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.

2．MTT甲瓒溶解液

2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。

2.2三联溶解液：

SDS10g，异丁醇5ml，10MHCl0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：

周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：

455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。

（个人觉得其溶解的能力不如DMSO强）

该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。

五、MTT法实验步骤

1:

胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。

对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。

以一般细胞培养常用的25cm2为例，

1）细胞密度在长到约80%~90%（下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。

2）另取一支新的15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基.

3）从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml,加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。

）细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。

此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。

比如：

生长较快的细胞密度可略小。

2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul,这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。

l注意：

因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。

下图可做为96孔板的的参考步局。

l对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。

但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。

另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。

5.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

6.终止培养，准备溶解结晶。

l溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解

1）MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。

将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。

有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。

个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。

采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

2）每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

l另一种方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）

1）MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。

这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。

（该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。

）

2）放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。

通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。

如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。

如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。

个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。

7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

六、MTT结果分析

关于如何计算IC50

　　1、改良寇式法:

lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）

Xm:

lg最大剂量

　　I:

lg（最大剂量/相临剂量）

　　P:

阳性反应率之和

　　Pm:

最大阳性反应率

　　Pn:

最小阳性反应率

举个例子：

各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下

药物浓度ug/ml

100

50

25

12.5

6.25

3.125

0

OD均值

0.080

0.093

0.236

0.374

0.441

0.531

0.614

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：

药物浓度ug/ml

100

50

25

12.5

6.25

3.125

抑制率

0.869

0.849

0.616

0.391

0.282

0.135

代入计算公式：

Pm=0.869

　　Pn=0.135

　　P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

　　Xm=lg100=2

　　lgI=lg100/50=0.301

　　lgIC50=2-0.301*（3.142-（3-0.869-0.135）/4）=1.655

　　IC50=45.186

该药物的IC50值为45.186ug/ml

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MTT所有问题大汇总

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实验前应明确的问题

1.选择适当的细胞接种浓度。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.药物浓度的设定。

一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。

根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。

切记！

否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3.时间点的设定。

在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4.培养时间。

200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.理论未必都是对的。

要根据自己的实际情况调整。

7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。

调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。

对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8.避免血清干扰。

用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。

由于试验本底增加，会试验敏感性。

因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。

在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

实验步骤

贴壁细胞：

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5.终止培养，小心吸去孔内培养液。

6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

悬浮细胞：

1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培养液稀释（储存液100ug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1：

10-1：

20）；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。

每板设对照（加100ul1640）。

2.置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

4.离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

5.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

MTT的配制

MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

PBS配方：

NaCl8g

Kcl0.2g

Na2HPO41.44g

KH2PO40.24g

调ph7.4

定容1L