初期给予红花注射液对大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡的阻碍.docx

初期给予红花注射液对大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡的阻碍.docx

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初期给予红花注射液对大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡的阻碍

初期给予红花注射液对大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡的阻碍

马全瑞，孙金萍，张莲香，李玲，张海雨，文玉军，秦毅

【摘要】目的探讨大鼠实验性脑出血后初期不同时刻注射红花注射液后，对血肿周围细胞凋亡及细胞凋亡相关蛋白等指标的阻碍。

方式将96只SD大鼠随机分成红花医治组、出血对照组、正常对照组，各组又再分成出血前24h、出血后0、六、1二、24h医治组。

各组均于脑出血后第72h处死，取脑，持续切片做TUNEL染色和免疫组化染色。

观看不同时刻用药对大鼠神经功能评分、血肿周围细胞凋亡数量及凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2/Bax等指标的阻碍。

结果与出血对照组相较较，各药物医治组的神经功能评分降低、Bcl-2/Bax蛋白比值增高、Caspase-3蛋白阳性细胞数减少、TUNEL阳性细胞数减少；红花注射液组在脑出血前24h和脑出血后0h给药医治的Bcl-2/Bax蛋白比值低于脑出血后六、1二、24h医治组、Caspase-3蛋白阳性细胞数高于脑出血后六、1二、24h医治组；在大鼠脑出血后6h、12h、24h注射红花注射液，出血灶周围Caspase-3阳性细胞慢慢增多、Bcl-2/Bax比值慢慢降低，出血后6h给药医治组的TUNEL阳性细胞数低于出血后24h医治组。

结论在不同时刻给予红花注射液医治脑出血大鼠，均能不同程度地增进脑出血大鼠神经功能的恢复，其中术后6h给药组医治成效最好，其可能通过增进Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax和Caspase-3蛋白的表达，从而抑制血肿周围的细胞凋亡。

【关键词】脑出血；细胞凋亡；红花注射液；大鼠

TheeffectofSafflorinjectiononcellapoptosisaroundthehematomaintheearlytimeafterexperimentalintracerebralhemorrhageinrats

【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofSafflorinjectiononapoptoticcellandproteinaboutapoptoticcellintheearlytimeafterexperimentalintracerebralhemorrhage（ICH）in96ratswererandomlydividedintotheremedialgroupwithICHandthecontrastgroupincludingICHcontrastgroupwithICHandnormalcontrastgroupwithoutICH.Theneachgroupofratsweredividedintofivegroupswhichwere24hoursremedialgroupbeforeICHofrats,0,6,12and24hoursremedialgroupafterICHofrats.Allratsinvolvedintheexperimentwerekilledonthe72ndhourfollowingICH.Theimmunohistochemicalmethodwasperformedinratbrainbyusingantibodycaspase-3orantibodybcl-2,bax.TUNELmethodwasusedtodetectapoptosisaroundtheComparedwithICHmodelgroup,Safflorinjectioncouldsignificantlyalleviateneurologicalsystemdamagesymptoms,heightentheratioofbcl-2/bax,andreducethenumberofcaspase-3positivecellandthenumberofTUNELpositivecellaroundhematomainICHrats.Thenumberofcaspase-3positivecellofSafflorgrouptreatedbeforeICH24hoursahead,afterICH0hourweremorethanthatofSafflorgrouptreatedafterICH6,12,24hours.Thebcl-2/baxofSafflorgrouptreatedbeforeICH24hoursahead,afterICH0hourwerelowerthanthatofSafflorgrouptreatedafterICH6,12or24hours.WhenthetreatedgroupwereinjectedSafflorafterICH6,12,24hours,Thenumberofcaspase-3positivecellaroundhematomawasgraduallyincreasedandthenumberofbcl-2/baxpositivecellwasgraduallydegradedandthenumberofTUNELpositivecellofSafflorgrouptreatedafterICH6hourswerelessthanthatofSafflorgrouptreatedafterICH24hours.ConclusionsWhenSafflorinjectionisusedearliertocureICH,itcandecreasetherateofcellapoptosisandcapase-3proteinexpression,heightentheratioofbcl-2/baxaroundthehematoma,especiallyintheSafflorgrouptreatedafterICH6hours.

【Keywords】intracerebralhemorrhage;apoptosis;Safflorinjection;rat

脑出血是一种发病率、病死率和致残率均较高的临床常见病和多发病，迄今为止对脑出血的医治虽较以往有专门大进步，但脑出血仍具有相当高的死亡率。

最近几年来，部份作者应用活血化瘀法医治急性期脑出血取得了必然的疗效，但在医治的机会上，专门在初期利用活血化瘀药医治脑出血患者尚存在较大的争议。

1材料与方式

材料

动物SD大鼠雌雄不限（126只），体重230～280g，由宁夏医学院实验动物中心提供，动物合格证号（SCXK〈宁〉）。

要紧试剂红花注射液（雅安三九药业，批号070304），Ⅶ型胶原酶（sigma公司），TUNEL检测试剂盒（Roche公司），Caspase-3多克隆抗体（武汉博士德公司），Bcl-二、Bax单克隆抗体（SataCruz公司），DAB染色试剂盒（北京中衫生物公司）。

方式

动物分组将大鼠（雌雄对半）随机分成红花医治组、出血对照组、正常对照组，各组又再分成出血前24h、出血后0、六、1二、24h医治组，各红花医治组每日腹腔注射红花注射液1次，剂量为（kg·d），正常对照组和出血对照组组每日腹腔注射等量生理盐水1次。

每日进行神经功能评分1次，各组大鼠均于脑出血后第72h处死。

脑出血大鼠模型制作依照脑立体定位图谱于大鼠前囟后，中线右边旁开钻孔，暴露硬脑膜。

微量进样器吸取μlⅦ型胶原酶和μl肝素的混合液μl，以硬脑膜平面为零点，缓慢进针，深度为，缓慢注入药物，注射完毕后留针10min，缓慢退出微量进样器，清洁伤口，缝合头皮，术后保温。

免疫组织化学染色石蜡切片，采纳SP法，DAB显色，光学显微镜下观看。

于200倍光镜下在血肿周围按顺时针方向在二、4、六、八、10、12六个时钟点当选择5个不重复视野区，计数阳性细胞数，计算平均值。

细胞凋亡的检测取与免疫组化染色相邻切片,用结尾脱氧核糖核苷转移酶介导的DUTP缺口结尾标记法（TUNEL），DAB显色。

于200倍光镜下在血肿周围按顺时针方向在二、4、六、八、10、12六个时钟点当选择5个不重复视野区，计数TUNEL反映阳性细胞数，计算平均值。

统计学处置结果用x±s表示。

统计学处置采纳软件包进行t查验、方差分析,显著性水准均为α=。

2结果

大鼠神经功能缺损评分麻醉苏醒后，模型组动物均显现不同程度神经功能缺损表现，依照Berderson评分标准对术后各组大鼠进行神经功能评分，各组评分情形见表1。

表1脑出血后各时相点神经功能评分注：

notes:

▲P<，VSICHgroup

免疫组化Caspase-3蛋白表达以细胞浆或细胞核中呈棕黄色着色的颗粒为阳性细胞，Bcl-2和Bax蛋白表达均以细胞浆呈棕黄色着色为阳性细胞，以神经元细胞表达为主，而且要紧集中在血肿周围脑组织。

正常对照组也可见到较少的Caspase-3蛋白、Bcl-2蛋白和Bax蛋白阳性细胞表达，但Bcl-2/Bax的比值始终接近1。

TUNEL染色依照免疫组化的结果，选取不同显著的两个时刻点进一步做TUNEL染色，TUNEL阳性细胞以细胞膜周边染色质堆积染色呈棕黄色或细胞核着色呈棕黄色评判为TUNEL阳性细胞。

在血肿周边的外围，以神经元为主，少部份是神经胶质细胞和血管内皮细胞。

ICH各组、各时刻点凋亡细胞表达情形见表二、表3。

表2各药物在不同时刻点给药时血肿周围Caspase-3、Bcl-二、Bax阳性细胞记数注:

VSICHgroup，▲P<,VS24hoursaheadremedialgroup,◆P<,VS24hoursaheadremedialgroup,★P<,VS0hoursremedialgroup，●P<,VS0hoursremedialgroup,■P<表3各组在术后六、24h给药时血肿周围TUNEL阳性细胞数注：

▲P<，VSICHgroup3讨论

脑出血是一种严峻危害人类生命健康的临床常见病和多发病。

据统计，在我国脑出血占急性脑血管病（脑卒中）的40%～50%，是脑卒中死亡率最高的临床类型，脑出血后30天内病死率接近50%，许多存活者遗留明显的神经功能缺失。

在医治上目前临床上除运用传统脱水药、手术清除血肿外，医治手腕较少，无其他特效的方式［1］，且相当部份脑出血患者虽初期行血肿清除，但预后仍然不佳。

千百年来中医中药在脑卒中的医治得以普遍的应用，部份作者应用活血化瘀法医治急性期脑出血取得了必然的疗效，但在医治的机会上专门在初期利用活血化瘀药医治脑出血患者尚存在较大的争议。

文献说明，细胞凋亡是脑出血后细胞死亡要紧途径之一［2］。

各类动物实验说明，脑出血后4～6h细胞凋亡即开始显现，凋亡顶峰在脑出血后48～72h［3］。

另外，有研究说明：

脑细胞缺血后先显现促凋亡基因表达，后显现神经元群体的凋亡，这就为医治提供了时刻窗，从理论上推测若是能在发病初期抑制促凋亡基因的表达或增进抑制凋亡基因的表达，就能够有效地爱惜神经元细胞的损伤。

目前以为，哺乳动物的细胞凋亡至少由两条通路组成，即死亡受体通路和线粒体通路，这两条凋亡途径不是孤立的,后期的一起途径是Caspases的激活，其中caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶，在细胞凋亡分子机制网络中居核心地位［4］。

线粒体在多种凋亡途径中起到了核心作用［5］，在线粒体通路调剂细胞凋亡中，Bcl-2基因家族是目前较为公认与之紧密相关的基因。

Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族中已被发觉的与细胞凋亡关系紧密的两种基因，是一对在功能上彼此对立的细胞凋亡调控基因，在中枢神经系统中均有表达。

Bcl-2和Bax是两类典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，Bcl-2与bax结合成异二聚体是Bcl-2发挥抗凋亡活性所必需的［6］，Bcl-2/Bax异二聚体，可通过阻断细胞色素C的释放，抑制下游Caspase-3的激活，从而抑制凋亡的发生，即细胞内Bcl-2与Bax比例决定受凋亡信号刺激细胞的最终命运，Bcl-2/Bax值增加，细胞凋亡减少；反之，那么诱发细胞凋亡机制的启动［7］。

脑出血后脑内血肿，中医以为离经之血即为淤血，治法也应活血化瘀。

祖国医学以为血瘀是中风的本质，活血化瘀是医治中风的全然大法，但在医治机会上存在较大争议。

有作者以为活血化瘀不论在初期前驱病症、发作期，仍是恢复期都可应用。

专门提出，在急性脑血管疾病中，操纵出血不是采取止血方式，而是应用活血止血、化瘀止血、理气止血等法。

红花作为一种应用普遍的强活血药，临床普遍应用于脑中风的医治。

现代药理研究显示红花具有:

扩张血管、降低血压［8］；抑制血小板活化因子诱发血小板聚集、释放及血小板内游离钙浓度升高；抑制诱发的人中性粒细胞聚集、粘附［9,10］，提高大鼠的纤溶性［11］；抑制缺血脑线粒体膜流动性的降低、线粒体肿胀、脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和降低细胞色素氧化酶活性；抑制Ca2+过量摄入，改善线粒体呼吸功能，拮抗氧自由基［12］。

众多的医家利用活血化瘀药多在脑出血的亚急性期（3天或3天以后）。

况时祥［13］以为活血化瘀药在脑出血急性期的要紧作用还在于改善由出血而引发的血液循环障碍，减轻脑组织的缺血缺氧损伤，而并非排除血肿或减轻脑水肿，反对一味寻求增进血肿清除的峻猛之药,并指出脑出血在利用活血化瘀维持谨慎态度，避免再出血，以为发病后6～24h内应为应用活血化瘀类药的最正确机会。

本实验的研究结果显示：

（1）实验性ICH后不同时刻点利用红花注射液医治均有成效。

（2）6h医治组和12h医治组医治成效优于其他组。

从行为学表现来看，从术后6h开始对大鼠进行神经功能评分，各医治组神经功能缺失病症明显轻于出血对照组，但各医治组组间比较无不同。

从凋亡相关蛋白表达情形来看，各医治组均能减少脑出血后的出血灶周围凋亡蛋白Caspase-3的表达，升高Bcl-2/Bax的比值，与出血对照组相较较不同有显著性（P<），且出血灶周围Caspase-3、Bax蛋白的表达情形与TUNEL染色结果相一致。

正常对照组组的Bcl-2/Bax的比值接近于1。

对本实验不同时刻用药的结果进行分析说明，在大鼠脑出血后6h以前给红花注射液医治，与大鼠脑出血后6h以后给红花注射液医治相较较出血灶周围Caspase-3阳性细胞明显增加、Bcl-2/Bax比值明显降低，提示红花注射液在脑出血后6h以前用药成效不睬想，可能与红花注射液在出血同时给药时抑制血小板聚集［9］，加重脑出血有关。

从TUNEL阳性表达情形来看，红花术后6h医治组和红花术后24h医治组凋亡率低于出血对照组，而且红花术后6h医治组较红花术后24h医治组血肿周围TUNEL阳性细胞数有所减少，但不同无显著性（P>）。

在大鼠脑出血后六、1二、24h注射红花注射液，出血灶周围Caspase-3阳性细胞慢慢增多、Bcl-2/Bax比值慢慢降低，与TUNEL染色结果相一致，提示红花注射液在大鼠脑出血6h以后及早用药成效比较理想，与文献［14］报导一致。

推测其可能与通过增进Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax和Caspase-3蛋白的表达，从而降低血肿周围凋亡细胞的表达有关。

另外在本实验中，在大鼠脑出血后0h给予红花注射液医治，有1例血肿周边见可到新鲜出血灶，说明出血6h之内应慎用活血化瘀药物来医治脑出血。

但在脑出血后康复医治时期应用红花注射液医治脑出血的成效如何有待进一步的研究。

综上所述，红花注射液初期医治实验性大鼠脑出血可明显减少血肿周围的细胞凋亡率，脑出血6h之内应慎用活血化瘀药物来医治脑出血，脑出血6h以后及早用药成效较理想。

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