紫铆因改善化疗损伤卵巢功能的研究.docx

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紫铆因改善化疗损伤卵巢功能的研究

紫铆因改善化疗损伤卵巢功能的研究

　　[摘要]目的探讨紫铆因对化疗所诱导大鼠卵巢功能损害的改善作用及其可能的作用机制。

方法选择雌性Wistar大鼠随机分为对照组、化疗组、联合治疗组（环磷酰胺+紫铆因）和紫铆因组，每5天测重；苏木精-伊红染色观察卵泡发育和各级卵泡计数；Elisa法检测雌激素、孕激素水平；Westernblot检测Sirt1和CleavedCaspase3蛋白表达水平。

结果化疗组大鼠体重、卵巢质量明显小于对照组，联合治疗组则明显高于化疗组。

化疗组大鼠动情周期紊乱，联合治疗组阴道细胞涂片表现为规律的动情周期。

化疗组卵巢结构破坏，始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡均少于其他三组。

联合治疗组血清E2水平显著高于化?

?

组，FSH水平显著低于化疗组。

Westernblot结果显示化疗组Sirt1蛋白水平低于对照组，CleavedCaspase3蛋白水平高于对照组，相反，联合治疗组的Sirt1蛋白水平高于化疗组，CleavedCaspase3蛋白水平低于化疗组。

结论紫铆因可以改善化疗对大鼠卵巢功能的损害，其作用机制可能与上调Sirt1抑制细胞凋亡相关。

　　[关键词]紫铆因；化疗；卵巢；Sirt1；凋亡

　　[中图分类号]R711.75[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2016）34-0035-05

　　Studyontheeffectofbuteinontheimprovementofimpairedovarianfunctioninducedbychemotherapy

　　ZHANGQiongLIANGZongwenZHANGAnqiLUXiaoshengZHUWang’aiHUYue

　　DepartmentofGynecologyandObstetrics，theSecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren'sHospitalofWenzhouMedicalUniversity，Wenzhou325000，China

　　[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectofbuteinontheimprovementofimpairedovarianfunctioninducedbychemotherapyinratsanditspossiblemechanism.MethodsFemaleWistarratswererandomlydividedintocontrolgroup，chemotherapygroup，combinedtreatmentgroup（cyclophosphamide+butein）andbuteingroup.Theywereweighedevery5days；thedevelopmentoffolliclesandthecountoffolliclesatalllevelswereobservedbyhematoxylin-eosinstainingmethod.ThelevelsofestrogenandprogesteroneweredetectedbyElisamethod.WesternblotwasusedtodetecttheexpressionlevelofSirt1andCleavedCaspase3.ResultsRats'weightandovaryweightinthechemotherapygroupweresignificantlylowerthanthatinthecontrolgroup，andthecombinedtreatmentgroupwassignificantlyhigherthanthatinthechemotherapygroup；inthechemotherapygroup，theestrouscycleofratswasdisordered，andthevaginalsmearinthecombinedtreatmentgroupshowedregularestrouscycle；inthechemotherapygroup，thestructureofovarywasdestroyed，andprimordialfollicles，primaryfollicles，secondaryfolliclesandantralfollicleswerelessthanthoseintheotherthreegroups；thelevelofserumestradiolwassignificantlyhigherinthecombinedtreatmentgroupthanthatinthechemotherapygroup，andthelevelofFSHwassignificantlylowerthanthatinthechemotherapygroup；WesternblotanalysisshowedthatthelevelofSirt1proteininthechemotherapygroupwaslowerthanthatinthecontrolgroup，andCleavedCaspase3proteinlevelwashigherthanthatinthecontrolgroup.Incontrast，theSirt1proteinlevelinthecombinedtreatmentgroupwashigherthanthatinthechemotherapygroup，whiletheCleavedCaspase3proteinlevelwaslowerthanthatinthecontrolgroup.ConclusionButeincanimprovetheimpairedovarianfunctioninducedbychemotherapy；themechanismmayberelatedtotheup-regulationofSirt1ontheinhibitionofcellapoptosis.　　[Keywords]Butein；Chemotherapy；Ovary；Sirt1；Apoptosis

　　在女性生殖系统中，卵巢对化疗药物最敏感[1]，化疗药物在提高肿瘤和免疫性疾病治愈率的同时，会引起卵巢功能障碍、卵巢早衰甚至导致不孕不育，严重影响年轻妇女的生活质量和自信心[2]。

因此，如何在使用化疗药物的同时保护女性的卵巢功能有巨大的医学需求。

细胞凋亡被认为是化疗药物引起卵巢的结构及功能破坏从而导致卵泡丢失的机制之一[3]。

据报道，Sirtuin在维持卵巢功能中起重要作用[4]。

其中Sirtuin家族中的Sirt1，被称为是寿命延长的关键因子，是一种去乙酰化酶，能够将FOXO（forkheadboxclassO）去乙酰化从而抑制细胞凋亡[5]，而紫铆因是Sirt1的激活剂[6]，由此推测紫铆因是否能通过上调Sirt1而抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，从而对化疗损伤卵巢功能起到保护作用。

　　目前国内外均未见紫铆因与化疗损伤卵巢功能的相关报道，本文旨在探讨紫铆因预防性应用对化疗后卵巢组织结构、卵巢内分泌功能、各级卵泡数量所起的一系列作用及机制，为临床肿瘤治疗和免疫性疾病中应用大剂量的化疗药物后卵巢功能保护的药物开发提供有实用价值的科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1主要试剂

　　紫铆因（TCI公司，日本）、环磷酰胺（恒瑞医药股份有限公司，中国；国药准字H32020857，0.2g）、兔抗Sirt1抗体（CellSignaling公司，美国）、兔抗Cleaved-Caspase3抗体（CellSignaling公司，美国）、羊抗兔二抗（ICLlab公司，美国）、BCA试剂盒（Thermo公司，美国）、大鼠FSH、E2Elisa盒（南京建成生物工程研究所，中国）。

　　1.2实验动物

　　健康成年雌性清洁级Wistar大鼠[北京维通利华实验动物中心提供，SCXK（京）2011-0011]60只，体重250～280g，标准条件（22℃～25℃，12h照明）下饲养，自由取水。

　　1.3实验方法

　　1.3.1分组取2月龄雌性Wistar大鼠60只，经阴道涂片确认有正常性周期后开始实验。

随机分为4组，对照组：

不加任何处理；化疗组：

建模后不做其他处理；联合治疗组：

建模同时喂服紫铆因5mg/kg45d；紫铆因组：

不建模同期喂服紫铆因45d。

　　1.3.2建模在体外建立化疗性卵巢早衰的大鼠模型，采用环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）腹腔注射建模，负荷剂量为50mg/kg，之后按8mg/kg的剂量连续腹腔注射14d[7]。

　　1.3.3观察指标观察大鼠体重、动情周期及卵巢大体情况，在建模前及建模起每天阴道涂片观察大鼠动情周期，每5天监测大鼠体重，并于建模后45d处死大鼠，取出双侧卵巢，观察大体外观变化及称重。

　　1.3.4检测大鼠卵巢的病理改变将实验所得大鼠一侧卵巢HE染色切片，观察组织形态学变化和卵泡计数。

计算方法：

计数每张卵巢组织切片上不同阶段的卵泡个数。

卵泡的组织学分类[8]：

始基卵泡：

单个卵母细胞被扁平的前颗粒细胞部分或完全围绕；初级卵泡：

单个卵母细胞被单层立方形的颗粒细胞包围，外周绕以一层扁平卵泡膜细胞；次级卵泡：

单个卵母细胞被一层以上颗粒细胞包绕，未出现卵泡腔；窦状卵泡：

存在卵泡腔并可见卵丘颗粒细胞。

　　1.3.5血清雌二醇、卵泡刺激素浓度检测在建模前及建模完成后第1、15、30、45天剪尾取血通过Elisa法检测雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，FSH）水平的变化。

　　1.3.6Westernblot分析实验所得大鼠另一侧卵巢在-80℃冰箱保存，用于Westernblot分析。

常规方法提取卵巢组织总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至硝酸纤维（NC）膜上，用质量分数为5%的BSA/脱脂牛奶封闭NC膜1h，加入一抗[Sirt1、CleavedCaspase3或β-actin（抗体）∶V（TBS）=1∶1000稀释于TBS中]4℃过夜；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗（1∶2000稀释），室温下缓慢振荡2h；最后用化?

W发光试剂盒显色、曝光，用图像分析软件对蛋白条带作灰度扫描分析，β-actin作为内参。

　　1.4统计学处理

　　采用SPSS16.0统计分析软件，计量资料以均数±标准差表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey检验，P　　2.2四组大鼠卵泡数量、卵巢质量及卵巢组织形态学改变比较

　　各组大鼠在喂养45d后，取大鼠双侧卵巢并称重。

结果显示，化疗组大鼠卵巢平均质量显著小于对照组（P0.05）。

　　给药期间，对照组和紫铆因组E2水平呈正常波动，化疗组大鼠的血清E2于第15天时明显下降，此后再波动，第45天显著低于对照组（P　　本研究观察成年雌性大鼠在化疗和紫铆因干预下卵巢Sirt1及促凋亡蛋白CleavedCaspase3的表达水平。

结果显示，化疗组Sirt1蛋白的表达相对于对照组明显降低，而联合紫铆因治疗组Sirt1蛋白水平比对照组显著增高。

既往研究提示，紫铆因是Sirt1的激活剂[6]，而Sirt1是寿命延长效应的关键因子。

对Sirt1转基因小鼠研究发现其性成熟延迟而Sirt1基因缺陷小鼠不能生育[20]。

由此可见Sirt1对卵巢功能有着重要作用。

与对照组相比，化疗组的卵巢CleavedCaspase3蛋白表达明显增高，表明化疗对卵巢功能的损伤；而化疗联合紫铆因治疗能显著下调CleavedCaspase3蛋白表达，起到调控卵巢颗粒细胞凋亡的作用。

本研究结果显示，Sirt1能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。

因此推测，紫铆因可能通过激活Sirt1，抑制细胞凋亡，从而实现对化疗损伤卵巢功能的改善。

　　综上所述，紫铆因可以改善化疗对大鼠卵巢功能的损害，其作用机制可能与激活Sirt1、增加Sirt1表达、抑制细胞凋亡、维持卵泡池储备相关。

本研究为临床肿瘤治疗和免疫性疾病中应用大剂量化疗药物后卵巢功能保护的药物开发提供新的思路。

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　　（收稿日期：

2016-09-16）