整理AFP的检测1班3组.docx

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整理AFP的检测1班3组

AFP的免疫检测

甲胎蛋白（AFP）主要在胎儿肝中合成,分子量6.9万,在胎儿13周AFP占血浆蛋白总量的1／3。

在成人,AFP可以在大约80％的肝癌患者血清中升高，在生殖细胞肿瘤出现AFP阳性率为50％。

在其他肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。

但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。

过去一直认为是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。

近年大量的临床却发现，AFP达到上千，但多年都没有肝癌的迹象；同时发现约20％的晚期肝癌患者，直至病故前，AFP仍不超过10。

甲胎蛋白是肝癌的特异性标志，但血清甲胎蛋白阳性未必都是肝癌。

在临床中发现，血清谷丙转氨酶升高的患者同时有血清甲胎蛋白升高。

一、AFP单克隆抗体的制备

单抗的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，可重复性高，对环境的高度敏感性，弱凝集反应和不呈现沉淀反应，便于人为处理和质量控制并且来源容易。

1、原理：

是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。

这两种细胞分别是经抗原免疫能产生抗体的小鼠脾细胞和能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞，用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂使细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择基的作用只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养，最终获得既能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。

将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。

2、制备步骤

1）获得抗原：

市场上购得商品化AFP,免疫BALB/c小鼠，获得致敏的B淋巴细胞；

2）细胞的选择与融合：

建立杂交瘤细胞的目的：

是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原（AFP）免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。

脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。

而另一个细胞则是为了保持融合后的细胞在体外能够长期存活并无限分裂、繁殖，通常选择小鼠骨髓瘤细胞。

细胞的融合是产生杂交瘤细胞的中心环节，使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起，最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。

聚乙二醇是目前最常用的细胞融合剂，一般的浓度为40%左右。

步骤：

将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:

2~1:

10比例混合，加入PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在2分钟以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液至失去融合作用，融合细胞形成具有2个或多个核的异形体，最终产生杂交细胞。

3）选择培养基

肿瘤细胞合成DNA通常途径有两条：

一为生物合成的主要途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另为替代途径，叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合成DNA。

HAT培养液筛选后，只有具有两亲本细胞双重特性的杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。

4）阳性杂交瘤细胞的克隆化培养（有限稀释法）

有限稀释法的原理为将细胞悬液连续稀释，最终至96孔板每个培养孔内平均含一个细胞，培养3~4天后，选择能分泌抗体的单个细胞群落阳性孔，反复多次克隆，获得由单个细胞增殖形成同源性的杂交瘤细胞克隆。

方法：

经有限稀释后，将细胞培养至覆盖0%~20%孔底时，吸取培养上清用ELISA测抗体含量，依AFP抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞克隆化，后进行抗原特异的ELISA测定，选出高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

目前采用液氮保存杂交瘤细胞。

细胞放入液氮前，需要逐步降温，如果冻存管放置于-80℃低温冰箱过夜后再放入液氮中，可长期保存。

复苏细胞时，冻存管取出后，立即37℃水浴，使之融化。

5）AFP单抗获得（动物体内诱生法）

常选用BALB/c小鼠或与BALB/c小鼠杂交的F1代小鼠为接种动物。

接种前一周，在小鼠腹腔内注入降植烷或医用石蜡油0.5ml。

接种时，每次向小鼠腹腔注射（0.5~1）×10^6个杂交瘤细胞。

接种后10~14天，可分次采集腹水，一只可得10~20ml。

将收集的腹水离心去除细胞，灭活（56℃30分钟），再离心，取上清液，加入0.1％叠氮钠，分装保存于-20℃。

6）单克隆抗体的纯化（亲和层析法）

亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。

所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

方法：

取适量腹水离心取上清，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释4倍，4℃过夜，离心取上清，按柱体积1/10加样，用0.01mol/LPH7.4的PBS液洗脱，流速为1ml/min，再用柠檬酸缓冲液洗脱抗体，收集洗脱成分。

7）、单克隆抗体鉴定：

包括特异性鉴定、效价测定、纯度鉴定及亲和力鉴定

二、检测方法

1.化学发光免疫分析技术

（1）化学发光酶免疫分析（CLEIA）

1）原理：

用参与催化某一化学发光反应的辣根过氧化物酶来标记AFP单克隆抗体，与待测标本中相应的抗原AFP发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物鲁米诺，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。

2）操作方法：

①抗体包被：

由聚苯乙烯高分子单体聚合成的微球包被AFP单抗

②加样：

标本-洗涤-辣根过氧化物酶标记的单抗-洗涤-加底物鲁米诺，H2O2和发光增强剂

③显色：

辣根过氧化物酶催化鲁米诺显色

3）方法学评价：

发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长，检测方式简单，成本较低。

（2）直接化学发光免疫分析

1）原理：

用化学发光剂吖啶脂直接标记AFP单克隆抗体，与待测标本中相应的抗原AFP发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶脂标记抗体复合物，加入氧化剂H2O2和pH纠正液NaOH，成为碱性环境，吖啶脂即可在不需要催化剂的情况下分解、发光。

由集光器和光电倍增管接收，记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分，与待测抗原量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。

2）操作方法：

①抗体包被：

由聚苯乙烯高分子单体聚合成的微球包被AFP单抗，封闭

②加样：

标本-洗涤-加入吖啶酯标记的AFP单抗-洗涤-加入氧化剂（H2O2）和PH纠正液（NaOH）

③显色：

吖啶脂在碱性环境中直接分解发光

3）方法学评价：

CLIA技术是近年来发展．起来的新技术，它继承了同位素灵敏度高的优点，同时克服了其放射性污染及半衰期短的缺点。

由于采用自动化仪器分析，实验条件标准化，人为影响小，试剂稳定，操作简单无污染。

（3）电化学发光免疫分析（ECLIA）

1）原理：

是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。

2）操作方法：

①抗体包被：

由磁性微球包被AFP单抗

②加样：

标本-洗涤-加入三联吡啶钌标记的AFP单抗-洗涤-加入电子供体三丙胺（TPA）缓冲液

③显色：

三联吡啶钌和TPA在电场中进行电子转移并发光

3）方法学评价：

电化学发光免疫分析法是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,包括电化学和化学发光两个过程,可对反应进行精确控制,能对各种物质进行快速分析,是目前最先进的标记免疫检测技术，其灵敏度高，准确性好、快捷、简便,超过常用放射免疫法和酶联免疫法，可为临床提供理想的检测结果。

但仪器昂贵,试剂成本也较高,难以在基层医院开展。

2．酶联免疫吸附试验（ELISA）——双抗体夹心法

1）原理：

先将特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体；加入待测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤除去其他游离成分；然后加入酶标记抗体并温育，使固相抗体抗原复合物与辣根过氧化物酶标记抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物（双抗体夹心），洗涤除去游离酶标记抗体；加底物，固相载体结合的酶可催化底物成为有色产物，根据产物的显色程度进行抗原的定性或定量检测。

2）操作方法：

①抗体包被：

将AFP单克隆抗体溶于缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液）中，加于由聚苯乙烯制作的ELISA板孔中，4℃过夜或37℃2小时，再用5%-20%的小牛血清封闭。

②加样：

将包被孔编号，设置空白对照，再在相应的孔上分别加入阴阳性对照和待测样品，随即加入由改良过碘酸钠法制备的酶标抗体。

轻轻振荡混匀后，置37℃温育。

③洗涤：

在洗板机上选择5次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。

④显色：

每孔加底物，再加显色剂，充分混匀，室温（18~25℃）避光反应5分钟。

⑤终止每孔加硫酸终止液终止反应，阳性者从蓝色变为黄色。

⑥结果判断：

酶标仪检测：

选择波长450nm，用空白孔校零，在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。

计算：

用双对数线性回归或其他适宜的曲线拟合方式绘制标准曲线，利用该标准曲线计算待测样品的AFP含量。

3）方法学评价：

酶联免疫吸附法操作简单，适用基层单位使用，但灵敏度和精密度稍差，线性范围较窄，操作简单,但其线性范围较窄,而且存在“钩状效应"。

3．胶体金免疫技术——斑点金免疫层析试验（DICA）

1）原理：

是将胶体金标记技术和蛋白质技术相结合的以醋酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。

在膜的一端滴加的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，如同层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判读实验结果。

2）操作方法：

在进行任何测试前必须先完整阅读使用说明书，使用前将试剂和样品恢复至室温。

取出检测试纸条后应在1小时内尽快使用。

将试剂条按箭头方向插入血清标本中，至少10秒钟后取出平放于干净平整的台面上；亦可以不取出，一直放在标本中直到读结果。

注意：

血清液面不能超过试剂条的标记线。

等待红色条带的出现，测试结果应在10－30分钟读取。

3）结果判断：

阴性结果：

仅出现一条红色条带，即对照线区出现有色条带，检测线区无色，为正常。

阳性结果：

出现两条红色条带，即对照线和检测线区均出现红色条带，表明AFP含量高于25ng/ml。

无效结果：

当对照线区未出现有色条带，表明试验失败或试剂失效，需进行重复检测。

注意：

在规定的观察时间内，不论检测线区有色条带的颜色深浅，即使非常弱的色带也应判为阳性。

4）方法学评价：

斑点金免疫层析试验，本法虽然存在灵敏度及准确度不及ELISA和化学发光等方法，但本法除层析条装置外，不需任何仪器设备。

且具有操作简便，快捷以及操作人员不需技术培训，试剂稳定，便于保存等特点，故临床可用于某些疾病的普查。

4.时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）——双抗体夹心法

1）原理：

固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，在酸性增强液作用下，Eu3+解离下来并被增强液中的螯合剂螯合成一个具有高强度荧光的稳定螯合物，在340nm激发光下发射613nm荧光。

镧系元素的荧光光谱Stokes位移较大，一般为273nm，很容易利用简单的滤光片把激发光和散射光分开，同时镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10-1000微秒），检测时可在短寿命本底荧光完全衰变后，再测定镧系元素螯合物的特异性荧光。

因此选择镧系元素Eu3+作标记物。

Stokes位移：

激发光谱与发射光谱的波长差，越大越好。

2）操作方法：

①包被：

将AFP特异性抗体包被于固相载体上

②加样：

加入待测标本——洗涤——加入Eu3+标记的抗体（利用具有双功能基团的螯合剂，一端与Eu3+结合，另一端与抗体上的氨基结合）——洗涤——加入酸性增强液

3结果测定：

在340nm的激发光照射下，游离出的Eu3+螯合物可发出613nm的荧光。

经时间分辨荧光检测仪测定并推算出待检抗原的含量。

3）方法学评价：

TRFIA是20世纪80年代迅速发展起来的一种公认最有发展前途的非放射免疫标记技术,它采用镧系金属离子作为示踪物,利用时间分辨荧光测定法排除了非特异荧光干扰,真正实现零本底、灵敏检测超过TPFIA法；对AFP的检测可以看出,该法对肝癌、肝硬化、肝炎患者中AFP含量检测与RIA和ECLIA无明显差异，相关性和精密度等指标都与另两种方法相当。

具有灵敏度高示踪物稳定、标准曲线剂量范围宽、自动化程度高、操作简便。

仪器和试剂较为便宜等,造合在各类医院中开展,是一种较理想的非放射性标记分析方法。

5.速率散射比浊法

1）原理：

抗原抗体混合瞬间便发生反应，在抗体过量的前提下，反应由慢到快，单位时间内形成的复合物不断增多，随后逐渐减慢，连续动态检测可发现某一时间段抗原抗体反应速率最快，单位时间内形成的免疫复合物最多，散射光强度变化最大，即速率峰，该峰值大小与抗原浓度呈正相关。

选取速率最大，且与被测物浓度变化呈线性关系的速率峰值，制作剂量-反应曲线，通过计算机计算可获得被测物浓度的量。

2）操作方法：

①仔细阅读说明书，编制分析参数

②将待测标本和抗血清分别加入样本盘和试剂盘，输入命令，选择检测AFP，仪器自动取样检测并动态监测抗原抗体反应的速率，计算机对测量数据进行自动分析处理，即可得知标本中抗原含量。

注：

抗原过量检测：

在测定过程中，抗原抗体迅速反应，在规定时间内反应介质中的抗体应与标本中抗原全部结合，无游离抗原存在。

此时再加入已知的相同抗原，该抗原与剩余游离抗体结合形成复合物，可出现第二个速率峰值信号，由此证明第一次速率峰值信号全部由待测抗原产生。

如没有出现第二高峰，则说明待测标本中抗原浓度过高，测定结果不准确，提示应将标本进一步稀释重新测定，以保证检测结果的准确性。

3）方法学评价：

速率散射比浊法，是抗原抗体结合反应的动力学检测法，也是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速，灵敏，准确，精密等优点。

并且采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。

但仪器和试剂价格比较贵，对抗体的质量要求很高。

6.免疫放射分析（IRMA）——双抗体夹心法

1）原理：

先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。

2）操作方法：

用已知抗体包被于固相载体，用另一种已知抗体标记放射性核素125I,制备为标记抗体,与待测抗原反应后形成包被抗体-待测抗原-标记抗体复合物。

用已知浓度抗原的系列标准品进行反应，可得到一条正向剂量反应曲线，如将待测样品进行同样操作，则可从剂量反应曲线查得样品中的抗原浓度。

（3）环境影响评价中应用环境标准的原则。

3）方法学评价：

放射免疫技术有较高的灵敏度，精密度和准确度，线性范围宽，但是采用放射性核素作为示踪物，放射性废物的储存和销毁，均会对检验人员和环境造成一定放射性污，且标记物的半衰期短,试剂不易保存，因而限制厂其在临床的广泛使用。

三、新方法

（5）为保障评价对象建成或实施后能安全运行，应从评价对象的总图布置、功能分布、工艺流程、设施、设备、装置等方面提出安全技术对策措施；从评价对象的组织机构设置、人员管理、物料管理、应急救援管理等方面提出安全管理对策措施；从保证评价对象安全运行的需要提出其他安全对策措施。

对策措施的建议应有针对性、技术可行性和经济合理性，可分为应采纳和宜采纳两种类型。

1．液相芯片法

（1）报送审批综合性规划草案和专项规划中的指导性规划草案时，将环境影响篇章或者说明一并报送。

1）原理：

液相芯片体系由表面带有羧基基团荧光微球组成，荧光微球表面的羧基基团经活化后，可以更具待检的蛋白交联相应的抗体。

液相芯片的检测系统内置两束波长不同的激光发射器，一束激光用来激发荧光微球的自身荧光物质，根据探测到的荧光微球自身发出的荧光强度来决定探针分子的特异性（定性）；另一束激光用来激发报告分子PE所携带的荧光物质，通过对报告分子发出的荧光强度的测量，对待检生物分子进行定量或半定量。

液相芯片对于大分子蛋白的检测多采用类似免疫学上的双抗体夹心法。

2）方法学评价：

其检测的灵敏度和线性主要取决于抗体与待测蛋白结合的特异性和亲和力高低，还有抗体与荧光微球的交联效率。

（3）环境影响技术评估。

2.酶标醋纤膜对流参比电泳测定法

（3）建设项目对环境可能造成影响的分析、预测和评估。

1）原理：

待测血清、标准AFP和过氧化物酶标记的抗AFP抗体加至醋纤膜上;经对流电泳迅速形成沉淀线,经浸洗后,用酶促反应显示沉淀线。

沉淀线的特点与AFP含量有一定关系,可据此判断AFP含量。

『正确答案』A2）方法学评价：

本法灵敏、特异、简便、快速,具有一般设备的实验室均可进行此项测定。

本法检出水平达30～50ng/ml,灵敏度大大超过常规琼脂对流电泳法,与放射火箭电泳法的灵敏度相近。

本法与放射免疫测定法和放射火箭电泳法测定结果基本一致。

类风湿因子不干扰本测定,特异性优于EL1SA法。

一、安全评价

4.广泛参与原则。

特别鸣谢：

（五）建设项目环境影响评价文件的审批制作人员：

2011级检验一班21-30号：

邓顺江、苏静、谭诗琪、刘若愚、李素梅、杜思蓓、李微微、骆梦倩、鲜沁陶、周小燕

（3）专项规划环境影响报告书的内容。

除包括上述内容外，还应当包括环境影响评价结论。

主要包括规划草案的环境合理性和可行性，预防或者减轻不良环境影响的对策和措施的合理性与有效性，以及规划草案的调整建议。