绵羊骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定试验.docx
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绵羊骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定试验
绵羊骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定试验
1、相关定义
1.1、NSCs的定义及基本特性
神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）:
是一种潜能性细胞,能够自我更新,是在成年动物中枢神经系统内主要的细胞类型。
NSCs的基本特征:
（1）神经干细胞具有多向分化的潜能,可生成神经系统内各种类型细胞,并具有分化成熟的后代细胞的能力,其主要包括神经系统内存在的三类主要细胞如:
神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。
目前关于NSCs多向分化潜力性研究有了新的认识,通过一系列试验及实验表明NSCs具有很强的多向分化潜能,可以跨系或跨胚层,比如:
NSCs在一定条件下,可以分化为造血细胞并有效的重建造血系统,NSCs也可以向肌细胞分化等,因此,我们可将NSCs看作为具有神经多向分化潜能的干细胞。
（2）具有自我维持和更新能力（维持和更新能力是指在某一确定部位保持稳定的数量,和/或在必要时进行增殖的能力）:
NSCs通过两种分裂方式来达到增殖的目的:
即不对称分裂和对称分裂;对称分裂后,细胞可产生两个,分别为:
干细胞或两个祖细胞（progenitorcell）,干细胞和祖细胞是两个相对的细胞,祖细胞,自我维持,分化和更新能力受到相应的限制,仅具有单潜能或双潜能分化能力或其干细胞样特征只能维持相对较短的时7长春中医大学2014硕士学位论文文献综述间;而不对称分裂分别产生一个新的干细胞和新的祖细胞,祖细胞存活时间相对比较短,增殖后一部分发生迁移分化另一部分则死亡,因为干细胞则分化较为缓慢,所以维持干细胞库并且使其稳定的同时,相应的产生一些祖细胞以补充丢失死亡的同类细胞。
神经前体细胞一词,往往被一些学者教授用来代替干细胞及祖细胞两个不同阶段的细胞,前体细胞（precursorcell）是指在生长发育过程中他的出现比另一种细胞要早且属于前一阶段细胞。
1.2、表皮干细胞的概念及生物学特性
有多种分化潜能,具有自我更新能力和高增殖能力的细胞〔习。
按分化潜能的大小,干细胞可分为三种类型〔:
t]:
一类是全能性干细胞,它具有形成完整个体的分化潜能,如胚胎干细胞;另一类是多能性干细胞,这种干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能,但却失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受到一定的限制,如骨髓多能造血干细胞;第三类为单能干细胞（也称专能、偏能干细胞）,这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。
从发生机制来看,干细胞并不直接分化产生终末分化细胞,而是先分化成短暂扩充细胞（transitamplifyingCellSTAC）,这种细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力,因而是定向祖细胞（CommittedprogenitorS）。
短暂扩充细胞再经过几次到十几次不等的分裂后定向分化,进一步可分化为有丝分裂后细胞（p。
St-mitotiCCellS）及终末分化细胞（termi。
ally一differentiatedCellS）。
20世纪80年代初,BICkenbaCk以细胞标记滞留技术发现了鼠表皮中含有一细胞群落,可持续探测到其放射活性达280天,故命名为表皮干细胞。
表皮位于皮肤的最外层,为基底细胞、主要是由人表皮角蛋白形成细胞组成,角蛋白形成细胞由内向外依次棘细胞、颗粒细胞、透明细胞和角质细胞。
其中最内的基底膜上,形成基底层,是人角蛋白形成细胞的生发层。
基底细胞位于表皮基底细胞包括表皮暨南大学表皮干细胞的分离培养及蛋自组学研究干细胞、短暂扩充细胞和终末分化细胞。
此后研究表明,人和鼠的皮肤中约100/0的基底层细胞为慢周期细胞,这些细胞在体外培养条件下仅有约40%可形成大的克隆,也就是说基底层细胞中只有40k为表皮干细胞〔5,6〕。
动力学分析表明,表皮分两部分:
增殖部分和非增殖部分,其中,增殖部分由基底细胞和棘细胞组成。
业己证明,大部分能分裂增殖的细胞都粘附于基底膜上,当它们离开基底层后便不再分裂,经历终末分化,并且向皮肤表面移行,最终形成复层鳞状上皮,以避免下面活细胞层水分丢失和机械损伤。
这样,角质细胞持续不断更替脱落,然后又由基底层的细胞持续地增殖分裂更替。
而非增殖部分由透明层,颗粒层和角质层细胞组成,这部分所有的细胞都不具有增殖能力,细胞成熟和细胞凋亡并不伴有新细胞产生。
所有能够自我更新的组织都有干细胞,这些细胞长存,有强大的增殖分化潜能,有助于细胞更替。
位于表皮基底层的干细胞属于专能干细胞,它最终分化为角质化细胞。
随着发育生物学的发展,人们对表皮干细胞在伤口愈合中的作用得到充分的认识。
在人体不同部位皮肤更新周期约为2一4周,始终处于持续增殖、分化、脱落、消亡状态,并且增殖与消亡保持相对平衡,以保证皮肤的完整性。
现已证明表皮干细胞在维持表皮更新,保持细胞的产生和丢失平衡状态方面起着重要作用。
因此,表皮干细胞为皮肤组织特异性干细胞,是皮肤及其附属器官发生、修复、改建的关键性源泉t7」。
表皮干细胞是来自于外胚层的专能干细胞,通常处于静息状态,在形态学上表现为体积小,胞内细胞器稀少,细胞内的RNA含量低等非成熟细胞特征,其有两个基本特征:
慢周期性（标记滞留性）和自我更新能力。
慢周期性在体内表现为标记滞留细胞（label一retainingCell）,即在新生动物细胞分裂活跃时参入氖标的胸普,由于干细胞分裂缓慢,因而可长期探测到放射活性,如小鼠表皮干细胞的标记滞留可长达2年。
干细胞的自我更新能力表现为在离体培养时细胞呈克隆性生长,如连续传代培养,细胞可进行140次分裂,产生1xlo相个子代细胞〔川。
此外,表皮干细胞还有一个显著特点是对基底膜的砧附,主要通过表达整合素（integrins）实现对基底膜的勃附,这也是干细胞维持其特征的基本条件。
1.3、胚胎干细胞的概念及应用前景
1.1胚胎干细胞的来源1.1胚胎干细胞的来源1.1.1来自于早期胚胎内细胞团小鼠胚胎发育到致密桑椹胚时,胚胎细胞发生不对称分裂,具有顶端细胞膜的细胞以后发育成滋养外胚层（trophectoderm）,没有顶端细胞膜的细胞则构成ICM,在3.5dpc（dayspostcotium）时,位于囊胚的一端,此时ICM约有10~20个细胞,4.5dpc约有20~25个细胞,6dpc约有600个细胞,7.5dpc约有8060个细胞[2]。
大约在4.0dpc,ICM中紧挨着囊胚腔排列的一层细胞分化成胚外原始内胚层（extraembryonicprimitiveendoderm）,而剩余的ICM细胞通常称为”上胚层”（epiblast）。
胚外原始内胚层随后则分化成两种胚外细胞系:
体壁内胚层（parietalendoderm）（迁移到滋养外胚层的下面）和脏壁内胚层（与剩余的ICM紧密相连并共同附殖）[3]。
”上胚层”又可指附植后的早期阶段中位于脏壁内胚层下的细胞,它与附植前的上胚层在基因表达上有所不同,附殖前的上2昆白小鼠胚胎干细胞的分离、培养及鉴定胚层表达Fgf5、PRCE、OCT-4,附殖后的上胚层表达CRTR-1、REX-1、OCT-4,有无其他差别还不清楚[4,5]。
Rossant[6]、Beddington[7]等发现ES细胞只能来自于未附植前的上胚层。
1.1.2来自于原始生殖细胞PGCSs是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。
在体内,它们将分化为生殖细胞,为物种的延续提供基础;在体外,可利用PGCs建立多能性EG细胞系。
PGCs是早期胚胎外胚层细胞中的一小群细胞在细胞质因素和外在因子协同作用下演变而来的。
能清楚辨别小鼠PGCs的最早时间大约在交配后第7~7.25天,位于原条后端胚外中层内有8个PGC,高水平的表达碱性磷酸酶和Oct-4转录因子;以后迁移到内胚层,在原肠作用结束时有50~80个,在交配后8天于后肠内胚层和尿囊基部约有125个,8.5天PGC开始迁移,9.5迁移到背肠系膜,于10.5~12.5沿背肠系膜迁移到生殖嵴,在此过程中经5~6次分裂,其数量增加到约4000个,13.5天时约2.6万个。
在雄性性腺中,PGCs经过数次分裂而形成精原干细胞的前体-性原细胞（gonocyte）,而后附着在生精上皮上进入精子发生过程;在雌性性腺中,PGCs迅速分裂而形成卵原细胞（oogonium）,进入减数分裂期[8]。
在合适的微环境和多种细胞因子作用下,附植期的PGCs可以转化为EG细胞。
目前,至少有三种细胞外配体/受体信号系统被证实促PGCs的存活和增殖。
它们分别是:
（1）干细胞因子（stemcellfactor,SCF）及其酪氨酸激酶受体;
（2）碱性成纤维细胞生长因子（basic-fibroblastgrowthfactor,bFGF）和FGF受体;（3）白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor,LIF）家族细胞因子和通过gp130亚基传递信号的受体。
IL/LIF家族细胞因子、Oct-4及nanog基因可维持PGCs的未分化状态。
SCF、bFGF和LIF三者联合作用能使细胞内cAMP浓度升高,促使生长于饲养层上的PGCs长期增殖。
目前,尚未从怀孕后期动物胎儿性腺获得EG细胞系的报道,这可能是进入生殖嵴处于有丝分裂静止期的PGCs丧失了对SCF、LIF和bFGF的反应性,引起其发生的原因可能是某一或更多因子受体表达减少。
抑制细胞凋亡基因（Bcl-XL）和腺病毒蛋白（E1B19K）能阻止PGCs的凋亡和抑制其死亡。
接头蛋白（Grb2）也控制着生殖嵴PGCs的生长和存活。
另外,垂体环腺苷激活肽（PACAP-27,PACAP-38）也能促进PGCs体外增殖。
小鼠PGCs进入生殖嵴,SCF受体c-kit下调。
而处于有丝分裂或减数分裂静止期前的PGCs可能是细胞因子阻断了PGCs向非成熟生殖细胞分化,并促进其增殖。
研究发现,PGCs表面有SCF受体、LIF受体及bFGF受体,SCF、LIF、bFGF与其受体相结合,激活细胞内相应的信号传导通路,产生特定的PGCs表型。
几种细胞因子相结合,使得PGCs发育程序发生改变,阻断了其终末分化,刺激其大量增殖,得到EG细胞系[9]。
ES细胞和EG细胞在发育潜能和生长行为等方面有共同的特征,但它们并不完全一样,一个重要的区别是它们的胰岛素因子Ⅱ受体（insulin-likegrowthfactor-Ⅱreceptor,第一篇文献综述3IGFr-Ⅱ）基因甲基化状态不同,这可能反映着生殖嵴中的原始细胞和胚泡的ICM细胞属于两种不同的发育模式。
1.4、导学案的定义
“导学案”一词是随着高中新一轮的课改而产生的,众多学校将是否实行导学案教学作为新课改的标准之一。
不同的学者或研究由于研究的出发点或立场的不同,因此对导学案或学案的定义也有所差异。
有研究对学案的定义进行了梳理,总结出已有研究对学案的定义主要持三种观点:
（1）学案就是学习方案;
（2）学案就是学习材料;（3）学案就是案例。
①XX百科对导学案的定义为:
导学案,就是教师编制的用于引导学生自主学习、自主探究的学习方案。
②有研究者认为:
导学案是用于指导学生自主学习、主动参与、合作探究、优化发展的学习方案,也是教师指导学生学习的方案。
可以说是学生学会学习、学会创新、自主发展的路线图。
③有研究者认为:
学案是在教案的基础上,为开启学生智慧,发展学生能力而设计的,是在教师引导下由学生直接参与,主动完成求知的问题探索、要点强化等全程学习活动的案例。
④综合已有研究对学案的定义,结合作者对学案教学模式的亲身体验调查,本研究中对导学案的定义为:
导学案是指教师在分析学习需要的基础上,根据学习者特征而编制的,引导学生利用资源开展自主学习的学习指导方案。
一份完整的导学案应该充分利用资源,通过导学策略或导学任务设计发挥其重要的导学功能。
在这里,资源是导学案导学功能得以实现的前提条件,导学策略设计则是导学功能发挥的途径。
1.5、BMSCs的定义
自从发现BMSCs以来,其都被当做一种具有特征性的形态,表型及功能性质的细胞群体来研究,由于没有找到特异性的表面标志物,对BMSCs的定义一直备受争议。
PittenerMF等[3]提出的有关hMSC的定义是目前公认的“金标准”,即骨髓基质干细胞可在体外适宜刺激下向成骨细胞,成软骨细胞,脂肪细胞分化。
2006年,国际细胞治疗协会（InternationalSocietyforCellulartherapy,ISCT）确定BMSCs的鉴定标准为:
1.从骨髓中提取,在塑料培养皿内贴壁生长,在含血清的培养基内高度增殖。
2.表达CD105、CD73、CD90,不表达CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79a或CD19（CD34和CD45是造血干细胞阳性标记,在BMSCs上为阴性）;3.在体外可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
1.6、SNM的定义
关于SNM的定义,学者们的观点并无统一的定论,但基本上大同小异,大多认为SNM是一个有效分析工具,它是一个保护空间对新技术形成保护。
Weberetal.（1999）认为战略生态位管理在学术上定义:
通过为有前途的新技术、新工艺和新概念的故障试验台（实验,示范项目）的创造、发展和控制来达到了解环境（例如可持续性发展）和提高新技术的扩散率的目的w。
EmmanuelD.Adamides（2009）认为战略生态位管理（SNM）是基于”保护空间”而产生的政策驱动体制转变的战略,即生态位指的是新技术的产生、发展和应用。
受保护的微小的社会技术系统是围绕创新技术而形成的,为实验提供一个平台并学习它们有用的地方、未来的发展方向及促进它们传播的方式[51。
GeertVerbong（2010）则定义战略生态位管理是一个分析工具,尤其是通过社会性实验,来引进和推广具有革命性意义的新的可持续技术16]。
6第二章文献综述
1.7、SNM试验学习与市场生态tModelframework1?
第四章研究设计第四章研究设计4.1问卷设计4.1.1问卷基本结构本文研究的问题是:
试验学习与市场生态位之间的关系,外界支持作为调节变量对学习与市场生态位的影响以及组织特征对试验学习与市场生态位关系影响,因此要求问卷设计能为各部分研究内容提供所需的有效数据。
根据国外学者对各变量之间关系主要内容的描述以及主要研究方向,进行汇总提炼为本问卷变量的主要测度问句。
本研究问卷包括五部分内容:
一是背景说明,简要说明本研究的目的与意义,并承诺本研究仅供学术之用;同时还包括填写个人的基本信息。
二是企业的基本信息,如企业性质,企业所在行业,企业员工人数,销售额,利润率,研发费用等情况;三是试验学习的测量部分,包括了内部学习与外部学习两个方面,共13个问题。
四是外界支持部分,主要包括政府支持与其他机构支持,共9个问题;第五部分是市场生态位部分,分为保护撤销度,开发程度以及市场接受度三个维度,共24个问题。
问卷的变量测量部分采用李克特5分量表评估,1分至5分分别表示非常不同意志非常同意之间的各个程度。
4.1.2问卷设计过程本研究的整个问卷设计经历了一个详细斟酌,反复推敲的过程。
从2011年3月开始进行文献阅读整理,理论假设推导,设计问卷等工作,一直至10月中旬正式发放问卷,4月收回第一批问卷,整个过程历时约一年。
此次问卷的设计曾与有关专家、学者进行过反复探讨,并与梅州高新技术园区的部分企业高层管理者进行过多次访谈,并进行了预调査,收集反馈对调査问卷进行了多次的修改。
在进行相关文献收集过程中,由于战略生态位理论在国内鲜有学者进行研究,于是重点通过整理国外关于战略生态位针对梅州梅县扶大技术园区。
园区内具有63家企业,其中有国家级科技企业1家、省级科技企业10家,建立研发机构的企业2家,企业产品获得国家专利有11项。
主要产业有医药、电子、机械设备加工等。
2010年实现工业总产值5.8亿元、税收1.25亿元。
今年1一8月,预计工业总产值3.76亿元、税收1.15亿元,分别对比上年同期增长1%、70%。
根据本文研究目的,SNM实施过程所针对对象为具有开发新技术,并历经新技术从孵化至投放市场要求的企业,且在新技术成熟过程中受到国家政策、学习环境等因素影响。
而梅州扶大技术园区内企业较为符合研究对象特点,因此选取梅州扶大技术园区作为本次研究问卷发放对象。
4.2.2问卷发放与回收本次研究的样本为63个,第一期回收问卷为44份,其中未填写或者填写不太完整的无效问卷为1份,有效问卷为43份,第一期问卷的有效回收率97.7%。
在有效问卷43份中,只有32份问卷显示企业新技术已进入市场生态位阶段,符合本文研究重点,因此最终选取32份有效问卷作为本次研究的调查数据依据。
4.2.3样本量意义根据最小抽样量的计算公式,抽样量需要>30个才算足够多。
公式如下:
（Z?
/2）V其中,n表示样本量2;a表示方差,抽样个体值和整体均值之间的偏离程度,抽样数值分布越分散方差越大,需要的采样量越多;E表示抽样误差z;
1.8、冲击谱概念和定义
振动响应与冲击响应是有区别的。
在工程应用领域,常常把冲击视为对一种结构组织的激励,通过试验中结构的响应来表示冲击的效果[45]。
冲击的效应一般通过响应的峰值来体现,这里需要与傅里叶谱进行区分:
-10-哈尔滨工业大学工学硕士学位论文
（1）冲击谱是通过响应的峰值来描述冲击对模型的影响,而傅里叶谱是通过某些频率的幅值以及相位来描述冲击对模型的影响,从而定义冲击的。
（2）冲击响应谱与冲击信号傅里叶谱是不同性质的频率谱。
冲击响应谱不仅与模型系统的本身特性有关,还与冲击激励的波形有关。
模型系统的刚度、阻尼的改变,会对冲击响应谱的大小造成影响。
如果已知波形的参数,可以求得冲击响应谱;但是已知冲击响应谱,却不能求得冲击脉冲的波形。
通过以上分析,可知不能通过冲击激励系统的响应峰值来反求冲击脉冲的具体波形。
影响冲击信号傅里叶谱的因素包括:
脉冲波形的形状、脉冲周期、脉冲峰值。
即如果已知冲击波形,就可以求得傅里叶谱;如果已知冲击信号的傅里叶谱,也可求得脉冲的波形的具体数据。
（3）冲击对结构的影响因素主要包括:
冲击的响应峰值、结构的固有频率,而冲击的有效频率则体现在冲击响应的频域里[46]。
当只考虑系统的线性响应时,对理想的单自由度系统,给出冲击波形则系统响应只取决于两个因素:
临界阻尼系数、系统固有频率。
对这种只考虑两种参数的冲击响应谱试验,可以得到许多典型的、简单的峰值响应图。
可以通过这些典型模型的峰值响应曲线来实现对复杂模型的峰值响应曲线的研究,如正交振型叠加法。
由叠加法产生的误差需要另外考虑。
简单来讲冲击谱就是,通过不同的临界阻尼系数的系统的固有周期来描述峰值响应。
在二维冲击谱中,我们所研究的是以时间为横坐标的响应的最大值连接起来的形成的曲线。
实际上,三维冲击谱中,所研究的对象是以曲面的形式来呈现的,即在整个时间范围内的峰值响应的分布情况。
本文主要对悬置衬套的冲击动力学特性进行研究,故二维冲击谱能满足试验的要求。
悬置衬套可以看作为由n个单自由度的系统组成,各系统的固有频率不同,对各个系统进行特定的冲击激励,并且记录各个系统的最大响应,把这些特定频率的冲击上的最大响应表示在一张图表上,就可以得到我们需要的冲击响应谱。
1.9、NSLAB的定义
对于非发酵剂乳酸菌的定义来讲,现在比较实用的是”干酪中不作为发酵剂组成部分的乳酸菌,即不在干酪生产过程中产酸”。
干酪中的微生物可以简单地划分为两个主要类群,即发酵剂和次级微生物,发酵剂主要功能是能够在干酪制作过程中产生乳酸,而次级微生物不产生乳酸。
非发酵剂乳酸菌是次级微生物中的一类,不同品种的干酪中其非发酵剂乳酸菌的种类也各有不同,不是唯一确定的,但是其菌群状况往往与干酪的品种有关,它们的活动形成了不同品种干酪的特征。
非发酵剂乳酸菌是外来的微生物,在干酪生产中既能加速干酪凝乳,又能加速干酪成熟;它是唯一的能在干酪成熟期长大的微生物,会对干酪的质构产生影响（Foxetal.,1998）。
NSLAB导致干酪质构方面的变化是由于菌株的不同,而不是NSLAB数量多少（Shakeel-Ur-Rehmanetal.,1999）。
从本质上来讲,NSLAB是难以控制的,因此NSLAB来源的可变性决定了干酪质量的不同。
由于NSLAB本身拥有能够产生大量水解的酶,因此它具有对干酪的成熟产生影响的潜力（Williams,1997）。
既然干酪中不同种类的非发酵剂乳酸菌会对干酪产生不同的影响,所以研究NSLAB首先必须先了解其分类状况。
1.10、鉴定人的概念和性质
现在大陆法系国家的大部分学者都认为司法鉴定人的主要职责是为法官解决专业性问题,是”法官的科技辅助人”。
司法鉴定人由法官制定或聘用,进行准司法的活动。
这样的地位和活动性质,决定了大陆法系各个国家中的法律都要求鉴定人对双方当事人必须采取中立的立场,而不从属于委托的当事人或者司法机关。
在德国,鉴定人根据法院的委托对案件中涉及的某一专业问题做出鉴定,运用其专业知识对问题进行分析,认定再结合法律事实的推论得出结论,为案件的审理11北京交通大学硕士学位论文医疗损宙鉴定制度比较研究人员提供意见。
[15]《德意志联邦共和国民事诉讼法》第404条规定,法院决定鉴定人的人选以及与鉴定人的人数。
[16]
2、相关背景
2.1、研究背景
细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）近年来已成为干细胞领域的研究热点,其不仅能够支持造血系统,还可向中胚层和外胚层来源的组织分化,在特定的培养条件下分化为骨、脂肪、软骨、肌以及内皮组织[1-2]。
MSCs还具有自我更新的能力[3]。
同时在体外还可以抑制混合淋巴细胞增殖反应（MLR）体系中T细胞的增殖、在体内延长皮肤移植物存活。
该独特的免疫学特点使其长期存活于异基因环境中具有一定的优势。
近来有移植研究表明,MSCs植入不仅具有阻止免疫排斥发生的能力,同时具有免疫调节效应。
这样,MSCs作为临床治疗的一种手段成为可能。
在近几年较为前沿的组织工程骨、软骨、皮肤以及神经血管的研究中,MSCs发挥了巨大的作用。
目前,MSCs的研究主要集中于骨髓,其优势是在体外分离培养方法简单、增殖速度快。
但MSCs在成人骨髓内含量极低,约占有核细胞数的0.01%—0.001%,并且骨髓MSCs的数量和分化能力随着年龄的增长而减少和减弱[4]。
此外,不同的胚胎组织已经用来研究MSCs的存在,人类早期妊娠胎儿的骨髓、肝脏以及血液;中期妊娠胎儿的骨髓、肝脏、肺、脾脏、胰腺和肾脏都被证明富含MSCs[5]。
然而,胎儿组织样本难以获取。
这样,如何获得合适的MSCs来源以建立稳定的培养体系同时避免伦理道德问题的约束是一个挑战。
许多研究机构已经在其他组织中寻找到多能干细胞,包括动员的外周血[6]、脐血[7]、乳牙[8]、脐带间充质细胞[9]等,然而,从这些组织中得到的细胞数量十分有限[9]。
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