第六章基因重组与基因工程DOC.docx

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第六章基因重组与基因工程DOC

第六章基因重组与基因工程

教学大纲要求

1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；

2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；

3.了解重组DNA技术在医学上的应用。

教材内容精要

一、自然界的基因转移和重组

自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

基因重组的方式有：

接合作用、转化、转导、转座。

1．接合作用（Conjugation）当细胞（细菌）与细胞（细菌）相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞（细菌）转移到另一个细胞（细菌）。

2．转化与转导作用

（1）转化作用（Transformation）：

由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。

（2）转导作用（Transduction）：

当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

3．转座（转位）（Transposition）可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。

可分为插入序列（insertionsequenceIS）转座和转座予（transposons）转座。

4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。

基因重组有两种类型：

位点特异的重组（sitespecialrecombmatlon）和同源重组（homologousrecomblnation）。

二、重组DNA技术’

1．重组DNA技术的相关概念

（1）DNA克隆：

克隆（Clone）就是来自同一个体的相同的集合。

DNA克隆（DNAclone）：

应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。

DNA克隆又称基因克隆或重组DNA。

DNA克隆也指将DNA重组体引进受体细胞中，建立无性系的过程。

因此，又称为基因克隆（genecloning）、基因工程（gentreengneering）、重组DNA技术。

（2）工具酶；常用的有：

内切酶、连接酶、聚合酶I、反转录酶等。

在所有工具酶中以限制性内切核酸酶最重要。

限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）是指能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

根据组成和作用特性的不同，常用的限制性核酸内切酶可分为三类。

，重组DNA技术用到的为Ⅱ类。

其特点为：

①具有识别特异性：

识别DNA分子上特定的核苷酸序列，该序列一般呈回文结构（Palindrome），如：

E．CoRI识别的序列为5'GAATTC3'。

②具有切割特异性：

从某一特定位点或其周围切割，产生后产生粘性本端或钝性末端，如：

E．CoRI从G和A之间切开，产生两个粘性本端（5'G↑AATTC3'）。

不同的限制性内切核酸酶识别DNA中的核苷酸长短不一，切割位点的多少也不同，产生的片段大小各异。

（3）目的基因：

目的基因（targetgene）是我们要研究或利用的DNA序列或基因，称为目的基因。

目的DNA有两种类型：

cDNA和基因组DNA。

cDNA（ComplementaryDNA）是以RNA为模板，经反转录合成的与RNA互补的单链DNA。

以cDNA为模板经聚合反应可合成双链cDNA。

基因组DNA（genomicDNA）是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。

（4）基因载体：

也叫克载隆体（cloningvector）是携带目的基因，实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

具有转录和翻译所必须的DNA序列，可以完成目的基因表达过程的载载体称为表达载体（expressionvector）。

作为载体，必须要有独立的复制能力，可导入宿主细胞，并且要便于检测。

常用的载体有质粒DNA、噬菌体DNA、和病毒DNA。

质粒（P1asmid）是存在于细菌染色体以外的环状DNA分子。

质粒大小适宜，拷贝数多，易于转化，利于筛选，有理想的酶切位点。

噬菌体（phage）是侵袭细菌的病毒。

常见的噬菌体有λ噬菌体和M13噬菌体。

基因工程所使用的噬菌体DNA均是经过人工改造的。

Ml3噬菌体的基因间隔区插入E．Co1i的调节基因及LacZN一端146个aa残基编码基因，其产物为β-半乳糖苷酶的α-片段。

而突变型Lac-EColi可表达β-半乳糖苷酶的ω-片段（酶的C-端），单独的α-片段及ω-片段均无β-半乳糖苷酶的活性。

当舍有LacZ的M13噬菌体转化Lac-E．coli细菌时，α-片段及ω-片段共同表达，宿主Lac—E．COli细菌才有β-半乳糖苷酶活性，使特异的作用物变为兰色化合物，生长的细菌为兰色，这就是α-互补。

可用于重组体的筛选。

如果目的基因插入lacZ基因内，则LacZ不表达，为白色菌落。

2．重组DNA技术

一个完整的DNA克隆过程包括目的基因的获取（分），克隆载体的选择和构建（切），目的基因与载体的连接（接），重组体导入受体菌（转），重组体的筛选（筛），克隆基因的表达（表）六个过程。

（1）目的基因的获取：

可以通过化学合成、文库筛选，PCR等方法获得。

基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）：

转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库。

构建方法是把生物体全部的DNA提纯后，用限制性内切核酸酶，随机切割成许多片段，将所有片段均重组入同一类载体上，得到许多重组DNA分于，继而全部转入受体酋扩增，使每个细茼内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝，这样生长的全部细菌所携带的所有基因组DNA片段，即为整个基因组。

需要时用探针即可获得。

cDNA文库（cDNAlibrary）是与基因组DNA文库类似，以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的cDNA。

以总mRNA制作的cDNA文库，包含了细胞的各种mRNAcDNA。

聚合酶链反应（p01ymerasechainreaction，PCR）是DNA迅速大量扩增的方法，短时间内获得大量DNA，有利目的基因的获得。

（2）克隆载体的选择和构建：

根据不同的目的基因，选择不同的载体。

并选用限制性内切核酸酶切割目的基因和载体。

（3）目的基固与栽体的连接：

利用DNA连接酶将目的基因DNA与载体DNA连接在一起，形成重组体。

其连接方式有：

粘性末端连接、平端连接、同聚物的加尾连接和人工接头连接等。

（4）重组体导入受体菌：

即把重组DNA导入受体菌的过程。

根据载体的性质不同导入方式有：

转化、转染、感染等早入方法如下：

选择适当的受体茵。

符合安全标准，为限制酶和重组酶缺陷型。

感受态细胞（competentcell）：

具备接受外源DNA的能力的经过特殊方法处理的受体菌。

（5）重组体的筛选：

筛选出含重组DNA的受体菌，有直接筛选法和非直接筛选法。

抗药性标志选择，标志补救及分子杂交属直接选择法；免疫化学湘酶联免疫检测法属非直接选择法。

通过转化、转染、感染等，导入重组体的受体细胞，经过培养得到大量的菌落或噬菌斑，因为每一个重组体只携带某一段外源基因，转化或转染时，每一受体菌仅接受一个重组体分子，所以要将它们区分，并鉴定那一菌落，含有带目的基因的重组体。

即得到目的基因克隆。

（6）克隆基因的表达：

可以生成有价值的蛋白质或多肽。

原核生物表达体系；E．coil是最常见的。

运用E．COti表达有用的蛋白质必须使构建的表达载体符合以下标准：

舍有大肠杆菌适宜的选择标志，具有强启动子，舍有适当的翻译控制序列，合有合理设计的多接头克隆位点。

真核表达体系常见的有酵母、昆虫、哺乳类细胞等。

3．重组DNA技术与医学的关系：

现代分子医学是重组DNA技术及其他分子遗传学技术、理论与医学实践相结合的结果，特别是在疾病基因的发现、发展生物制药、DNA诊断、基因治疗、遗传病的预防等方面有重要意义。

[测试题]

一、名词解释

1．基因工程

3．转化作用

4．转导作用

5．同源重组

6．限制性核酸内切酶

7．回文结构

8．目的DNA

9．互补DNA

10．克隆载体

11．表达载体

12．质粒

13．α-互补

14．基因组DNA文库

15．感受态细胞

16．cDNA文库

二、填空题

1．自然界的常见基因转移方式有、、、。

2．不同DNA分子间发生的共价连接称为，有、两种方式。

3.由和介导的基因移位或重排称为转座。

4．基因工程的载体必须具备的条件有、、。

5．限制性内切核酸酶识别的核苷酸序列的个数为、和——，其切口有端和端。

6.基因工程常用的载体DNA分子有、和。

7．一个完整的DNA克隆过程应包括、、、、。

8．目的基因获取的途径或来源有、、、。

9．基因工程过程中重组体直接筛选法的方式有、、。

10．基因克隆真核生物表达体系常见的有、、表达体系。

11．根据重组体DNA的性质不同，将重组体DNA导人受体细胞的方式有、、等。

12．如果Mi：

的外源基因被插入到lacz基因内，则在含有X-gal的培养基上生长时会出现色菌落，如果在1acz基因内无外源基因插入，在同样的条件下呈现色菌落。

13．重组DNA技术中常用的工具酶有、、、。

三、选择题

A型题

1．cDNA文库包含

A．一个物种的全部基因信息

B．一个物种的全部mRNA信息

C．一个生物体组织或细胞的全部基因信息

D.一个生物体组织或细胞的全部mRNA信息

E．一个生物体组织或细胞所表达mRNA信息

2．关于接合作用正确的是

A．细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，染色体DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

B．细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，某些较大质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

C．细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，噬菌体DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

D.细胞与细胞或细菌通过苗毛相互接触时，所有类型的质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

E．细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，所有类型的噬菌体DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

3．基因工程的特点是：

A.在分子水平上操作，在分子水平上表达

B．在分子水平上操作，在细胞水平上表达

C.在细胞水平上操作，在分子水平上表达

D．在细胞水平上操作，在细胞水平上表达

E．以上均可以

4．实验室内常用的连接外源性DNA和载体DNA的酶是：

A．DNA连接酶B．DNA聚合酶IC．DNA聚合酶1

D．DNA聚合酶IE．反转录酶

5．用来鉴定DNA的技术是：

A．Northern印迹B。

Southern印迹C．Western印迹

D．亲和层析E.离子交换层析

6．用来鉴定RNA的技术是：

A．Northern印迹B。

Southern印迹

E.Western印迹D．亲和层析E.离子交换层析

7．重组DNA技术中常用的工具酶下列那项不是：

A.限制性核酸内切酶B．DNA连接酶C.DNA聚合酶I

D．RNA聚合酶E．反转录酶

8．F一细胞与F十细胞混合培养，产生F+细胞的过程为：

A.转化B．转导C接合n突变E.转位

9．DNA致癌病毒感染宿主细胞后，使之发生癌变是因为发生了：

A．转化B．转导E.接合D．转座E．转位

10．关于基因工程的叙述，不正确的是：

A．根据实验目的选择目的基因

B．选择一个适合的载体

C.把目的基因和载体分别用限制性核酸内切酶切开

D．连接酶只连接目的基因和载体

E．把重组体转化到细胞中去的过程不是绝对的

11．限制性核酸内切酶不具有那项特点：

‘

A.仅存在原核细胞中

B．用于重组DNA技术中的为I类酶

C.能识别双链DNA中特定的碱基顺序

D．具有一定的外切酶活性

E.辨认的核苷酸序列常具有回文结构NA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为eDNA文库，因此eDNA文

12．表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是[答案JE

A．正，coli表达体系B．原核表达体系C．酵母表达体系

D．昆虫表达体系E．哺乳类细胞表达体系

13．限制性核酸内切酶切割DNA后产生E

A.3'磷酸基末端和5'羟基末端B．5'磷酸基末端和3'羟基末端

C.3'磷酸基末端和5'磷酸基末端D．5'羟基末端和3'羟基末端

E.3'羟基末端、5'羟基末端及磷酸

14．下列描述最能确切表达质粒DNA作为克隆载体特性的是[答案]D

A．小型环状双链DNA分子B.携带有某些抗性基因

C.在细胞分裂时恒定地传给子代细胞D．具有自我复制功能

E．获得目的基因

15．在分子生物学领域，分子克隆主要是指

A．DNA的大量复制B．DNA的大量转录

C．DNA的大量剪切U．RNA的大量反转录

E．RNA的大量剪切

16．在重组DNA技术中，不常用到的酶是

A．限制性核酸内切酶B．DNA聚合酶C．DNA连接酶

D．反转录酶E．DNA解链酶

17．多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为

A.乎头末端B．3'突出末端C．5'突出末端

D．粘性末端E．缺口末端

18．cDNA是指

A在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA

D．在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA

C在体外经转录合成的与DNA互补的RNA

D．在体内经反转录合成的与RNA互补的DNA

E．在体内经转录合成的与DNA互补的RNA

19.基因组代表一个细胞或生物体的

A部分遗传信息B．整套遗传信息c-可转录基因

D．非转录基因E可表达基因

20．在基因工程中通常所使用的质粒存在于

A．细菌染色体B．酵母染色体C.细菌染色体外

D.酵母染色体外E．以上都不是

21.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是

A.化学合成法B．基因组文库抹C．cDNA文库法

D．聚合酶链反应E.差异显示法

22．重组DNA的基本构建过程是将

A.任意两段DNA接在一起B.外源UNA.接人人体叫A

C．目的基因接入适当载体D.目的基因接入哺乳类DNA

E．外源基因接人宿主基因

23．如果某限制性核酸内切酶识别的碱基序列为6个，则24Kb的一段随机的DNA序列出现的切口数为；

A．4次B．5次C．6次D．7次E．8次

24．关于限制性核酸内切酶的叙述，下列那项是错误的：

A．限制性核酸内切酶分为三类，用于基因工程的为1酶

B．限制性核酸内切酶切割后可产生枯性末端或平端

C．识别的核苷酸序列个数可以是6个或8个

D．识别的序列一般具有回文结构

E.识别的DNA为单链

25．关于基因工程的叙述，下列那项是错误的?

A.基因工程也称基因克隆

B．只有质粒DNA可作为载体

C.重组体DNA转化或转染宿主细胞

D.需获得目的基因

E.需对重组DNA进行纯化、筛选

26．有关质粒的叙述，下列那项是错误的?

A．小型环状双链DNA分子

B．可小到2～3Kb，大到数百个Kb

C．能在宿主细胞中独立自主地进行复制

D．常含有耐药基因

E．只有一种限制性核酸内切酶切口

27．下列那项不是重组DNA的连接方式?

A．粘性末端与粘性末端的连接B．平端与平端的连接

C.粘性末端与平端的连接D．人工接头连接

E.同聚物加尾连接

28。

关于基因重组的叙述，错误的是：

A．整段的DNA不能在细胞内进行交换

B．整段的DNA能在细胞内进行交换

C．整段的DNA能在不同的物种间进行交换

D.交换的DNA能在新的位置上进行复制、转录、翻译

E．基因重组可引起自然突变现象

29．基因重组的方式不包括：

A．转化B．转导C．转位D．转换E.整合

30．EcoRI切割DNA双链产生

A．平端B．5’突出粘端C．3’突出粘端

D．钝性末端E．配伍末端

31．催化聚合酶链反应的酶是

A．DNA连接酶B．反转录酶C．末端转移酶

D．碱性磷酸酶E．TaqDNA聚合酶

32．将PstI内切酶切割后的目的基因与用相同内切酶切割后的载体4A连接属

A．同聚物加尾连接B．人工接头连接C平端连接

D．粘性末端连接E．非粘性末端连接

33．重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是

A．DN~N聚合酶B．RNA聚合酶·C,DNA连接酶

0．RNA连接酶E．限制性核酸内切酶

34．以质粒为载体，将外源基因导入受体菌的过程称

A．转化B．转染E.感染D．转导E.转位

35．最常用的筛选转化细菌是否含质粒的方法是

A．营养互补筛选B．抗药性筛选E.免疫化学筛选

D．KR筛选E．分子杂交筛选

36．α-互补筛选法属于

A．抗药性标志筛选B．酶联免疫筛选C．标志补救筛选

D.原位杂交筛选E．免疫化学筛选

37．列常用于原核表达体系的是

A.酵母细胞B。

昆虫细胞C．D船L类细胞D．真菌E．大肠杆菌

38．在对目的基因和载体DNA进行同聚物加尾时，需采用

A.反转录酶D．多聚核昔酸激酶C.引物酶

D．RNA聚合酶E．末端转移酶

39．DNA克隆不包括下列那项步骤?

A．选择一个适合的载体

B．限制性核酸内切酶在特异位点裂解质粒和目的基因

C．用连接酶连接载体DNA和目的DNA，形成重组体

D．用载体的相应抗生素抗性筛选含重组体的细菌’

E.重组体用融合法导人细胞

40．下列那项不能作为表达载体导人真核细胞的方法?

A.磷酸钙转染B．电穿孔C．脂质体转染

D.显微注射E.氯化钙转染

41．下列那项不能作为基因工程重组体的筛选方法?

A．抗药性标志选择B．宿主菌的营养缺陷标志补救

C．原位杂交D．Southern印

A.将琼脂培养板上的转化子茵落经蒸汽裂解释放抗原

B．将固定目的基因编码蛋白质的抗血清聚乙烯薄膜覆盖在裂解菌落上

E.再使用’’P标记的DNA探针与薄膜反应

D．经放射自显影检出阳性反应菌落

E.免疫学方法特异性强、灵敏度高，尤其适用于选择不为宿主菌提供任何选择标志的基因

42．重组DNA技术不能应用于：

A.疾病基因的发现B．生物制药C．DNA序列分析

D.基因诊断E.基因治疗

43．基因重组是指DNA分子的：

A.共价连接且氢键连接巴离子键连接D．交换E.退火

44．下列那种药物不能用基因工程的方法生产?

A．胰岛素B．干扰素C．白细胞介素

D．性激素E．促红细胞生成素

45．DNA重组技术不能应用于下列哪个方面?

A.产前诊断B．携带者测试C.症候前诊断

D．遗传病的易感性E.传染病的传染性

46．一种可靠的DNA诊断学方法，下列那项是不必符合的?

A．能正确扩增靶基因

B．能准确区分单个碱基的差别

C．本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定

D．便于完全自动化操作

E.方法简便，易于推广应用

47．关于转化错误的是：

A．受体细胞获得新的遗传表型

B．外源DNA一定整合进受体细胞基因组

C．自然界中较大的外源DNA转化几率较低

D．自然界中较大的外源DNA转化几率较高

E．越大的外源DNA与染色体整合几宰越低

48．关于同源重组不正确的是：

A．同源重组不需要特异的DNA序列

B．同源重组要求两分子间序列必须相同。

C.ReeB；CD具有内切酶和解旋酶活性·

D．Holliday中间体的形成，是同源重组的重要步骤

EPCR技术

49．下列那种酶是重组DNA技术中最重要的?

A．反转录酶B．碱性磷酸酶巴末端转移酶

D．DNA聚合酶[E.DNA连接酶

50．重组DNA技术常用的限制性核酸内切酶为

A．I类酶B．Ⅱ类酶C．Ⅲ类酶D．Ⅳ类酶E．V类酶

51．在分子生物学领域，分子克隆专指

A．细胞克隆B．RNA克隆C．DNA克隆

D．抗体克隆E．n~RNA克隆

52．用于重组DNA的限制性核酸内切酶识别核苷酸序列的

A.正超螺旋结构B．负超螺旋结构C．α-螺旋结构

D.回文结构E．锌指结构

53．在基因工程中通常所使用的质粒是

A．细菌的染色体DNAB．细菌染色体外的DNA

E.病毒染色体DNAn病毒染色体外的DNA

E．噬菌体DNA

54．构建基因组DNA文库时，首先需分离细胞的

A．染色体DNAE．线粒体DNAC．总mRNA

D．tRNAE．rRNA

55．建cDNA文库时，首先需分离细胞的

A.染色体DNAB．线粒体DNAC．总mRNA

D．tRNAE．rRNA

56．设计聚合酶链反应的引物时，应考虑引物与模板的

A．5'端特定序列互补B．5'端任意序列互补

C．3'端特定序列互补D．3'端任意序列互补

E．中间序列互补

57．用于鉴定转化子细胞是否含重组DNA的最常用方法是

A.抗药性选择B．分子杂交选择C．RNA反转录

D．免疫学方法E．体外翻译

58.限制性核酸内切酶酶切后的DNA末端最常见的是：

A．平头末端B．3，突出末端C．5’突出末端D．粘性末堵E.缺口末端

59.能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶称为：

A．DNA内切酶B．限制性内切核酸酶

E.非限制性内切核酸酶D．限制性外切棱酸酶

E．非限制性外切核酸酶

60.cDNA是指：

A．在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA

B．在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA

C．在体外经反转录合成的与RNA互补的RNA

D．在体内经反转录合成的与RNA互补的RNA·

E．在体内经反转录合成的与RNA互补的DNA

61．基因工程中通常使用的质粒存在于：

A.细菌染色体B．酵母染色体C。

细菌染色体外

D．酵母染色体外E.以上均不是·

62．质粒的分子结构是：

A.环状双链DNAB．环状单链DNAC．环状单链RNA

D.线状双链DNAE．线状单链DNA

B型题

（1—3）

A.抗药性选择B．分子杂交选择C．RNA反转录

D.免疫学方法E.体外翻译

1．用于鉴定是否有质粒转入受体菌的一般方法是

2．用于鉴定转化子细胞是否含目的基因的常用方法是

3．利用目的基因表达产物的特异性抗体来筛选含目的基因的转化子

胞的方法是

（4—6）

A．限制性核酸内切酶B．DNA连接酶C．反转录酶

D．TaqDNA聚合酶E．碱性磷酸酶

4．识别DNA回文结构井对其双链进行切割的是

5．用于聚合酶链反应的酶是

6．将目的基因与载体DNA进行拼接的酶是

（7—8）

A.支原体B．衣原体C．