冰冻切片.docx

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冰冻切片

冰冻切片的免疫组化染色

1.新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片（也可-80℃保存），厚度为5～6μm。

2.载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3.如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4.染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。

5.PBS洗2次，每次5分钟，（必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔）

6.3%H2 O2灭活内源性过氧化物酶，20分钟，避光；

7.用PBS洗2次，每次5分钟；

8.正常血清封闭：

从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。

附：

正常血清配制（或按试剂盒规定的浓度配制）：

按1:

20比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl（10%抛洒量）计算。

9．滴加第一抗体：

用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2小时（也可置于4℃冰箱过夜）。

10．PBS：

5分钟，2次（置于摇床）。

11．滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。

12．PBS：

5分钟，2次（置于摇床）。

13．滴加三抗（SAB复合物），37℃，40分钟。

14．PBS：

5分钟，2次（置于摇床）。

15．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。

附：

DAB的配制①储备液（DAB25mg/ml）的配制：

DAB250mg+PBS10ml，待完全溶解后分装成1ml，100μl，50μl，20μ l等，-20℃，冻存。

②工作液：

DAB储备液20μl+PBS1000μl+3%H2O2 5μl

16．自来水（细水）充分冲洗。

17．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。

18．自来水冲洗返蓝，15分钟。

19．梯度酒精脱水：

80%，2分钟 95%，2分钟 100%，2次，5分钟。

20．二甲苯透明：

I，II（二甲苯）各5分钟

21．封片：

加拿大树胶（或中性树胶）封片。

免疫组化troubleshooting

1、石蜡切片和冰冻切片的比较？

（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一老师请教得出的结论。

因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。

（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。

缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。

当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。

（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。

由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

2、一抗的选择要点和技巧是什么？

（1）单克隆和多克隆抗体的选择。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。

单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。

另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。

（2）应用范围的选择。

有的一抗只能用于Westernblotting,或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。

（3）种属反应性的选择（speciesreactivity）。

这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。

（4）种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。

根据此来源来选择相应的二抗。

（5）生产厂家的选择。

如santaCruz公司抗体一般1ml,价格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul,价格2800元左右。

这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Westernblotting效果还可以。

3、在什么情况下使用Triton-X100？

（1）TritonX-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。

在免疫组织化学（%26gt;10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。

（2）其作用原理：

TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

（3）TritonX-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。

4、封闭血清的选择原则是什么？

（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！

（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。

（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

5、抗体孵育条件的比较？

（1）一抗孵育温度有几种：

4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：

这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

（2）二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。

6、一抗4度孵育后为什么要进行37度复温？

（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。

一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。

事实胜于雄辩！

7、DAB显色时间如何把握？

（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；

（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；

（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；

（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

8、免疫组化结果如何分析？

（1）阳性着色细胞计数法。

在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

（2）灰密度分析法。

通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用imagej进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

（3）评分法。

通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。

要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

9、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？

（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。

通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。

（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。

修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：

中性的、高pH的等）。

（3）微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。

10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min.

（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。

（3）现用现配，配好后4度避光保存。

11、如何才能充分脱蜡？

（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。

为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；

（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。

如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。

如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。

（3）当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果魁伟更好。

总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。

12、如何最大限度地降低组织非特异性染色？

（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。

这是最重要的一条。

（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

（5）缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；

（6）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；

（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。

13、苏木素复染时间的把握？

（1）苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。

不过这个如果染色不理想可以补救的。

即：

染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。

（2）盐酸酒精是分化，氨水是返兰。

作用不同。

片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

（3）如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。

14、PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择？

（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。

正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。

（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。

冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。

（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。

切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS,持续2分钟左右就完全足够了。

（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。

中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。

（5）常用试剂的配制和使用。

在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。

可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。

15、脱片产生的原因和如何防止脱片？

（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。

我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。

后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。

（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。

（3）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

（4）没烤好，时间短温度不够之类。

（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

（6）修复的问题：

抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。

此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。

（7）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。

基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。

16、背景染色较深的原因有哪些？

（1）抗体浓度过高：

一抗浓度过高是常见的原因之一。

解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：

解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。

现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

（3）DAB变质和显色时间太长：

DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。

配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。

DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。

不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

（4）组织变干：

修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。

解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：

原因上不清楚，但现象存在。

有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?

C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：

注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。

用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

17、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长？

返蓝可以用碱性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45度温水、冷水蓝化均可。

一般蓝化5~10min。

淡氨水有人用50ml自来水+三四滴的氢氧化铵。

免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。

由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。

需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。

虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：

无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。

一、无色片

染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。

这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：

1、真阴性结果：

整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。

2、假阴性结果：

即此阴性结果不是真实的反映。

假阴性结果又可分为两种情况：

（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。

出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。

获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。

由此表明：

制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。

（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。

比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。

也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。

为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：

在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。

如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。

如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。

如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB的配制过程。

这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。

解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。

如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。

如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。

反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。

应一一寻找原因。

阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。

自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。

在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。

另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。

因此，应另外设立一个已知的阳性对照。

这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。

在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。

为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。

另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。

一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。

设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。

病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。

因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。

抗体未覆盖上测试组织：

当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。

二、“杂音”染色片

免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。

“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。

1、全片着色

全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。

出现这种现象的原因有：

（1）抗体浓度过高：

一抗浓度过高是常见的原因之一。

解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：

解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。

现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

（3）DAB变质和显色时间太长：

DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。

配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。

DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。

不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

（4）组织变干：

修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。

解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：

原因上不清楚，但现象存在。

有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4度冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：

注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。

用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

2、切片边缘着色

切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。

产生的原因：

（1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。

解决办法：

制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

（2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。

解决办法：

试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。

用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

3、“阴阳脸”着色

指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。

其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。

如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。

通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。

另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。

对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。

有时，用DAKO（或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。

还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。

解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。

4、灶片状着色

切片中着色区东一块西一块，呈灶