猪诱导多能干细胞iPS及其分化发育研究.docx
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猪诱导多能干细胞iPS及其分化发育研究
项目名称：
猪诱导多能干细胞（iPS）及其分化发育研究
首席科学家：
刘林南开大学
起止年限：
2009.1至2013.8
依托部门：
天津市科委教育部
一、研究内容
拟解决的关键科学问题
探讨猪iPS的重编程机制，利用猪作为动物模型全面评估iPS的安全性、有效性是本项目拟解决的关键问题。
iPS在小鼠和人上的成功获取，将干细胞领域的研究带到了一个崭新的时代，为生命科学的未来发展带来了新的曙光。
然而，iPS仍存在很多的不确定安全隐患，有效性也有待证实，在小鼠、人之外的其它物种上尚没有报道，仍处于发展的起步阶段，还不能直接造福于人类，这归根结底是人们对其科学基础--细胞的重编程过程及其机制缺乏系统深入的了解。
我国人口增长压力大、出生缺陷多、老龄化加剧，人们对优质畜产品日益增长的需求和畜牧业发展滞后、家畜良种偏少、地方物种遗传资源流失严重之间的矛盾日益突出，是我国贯彻可持续发展、全面建设和谐社会所面临的严峻挑战。
解决这些国家重大需求问题，必然要求我们对以iPS、ES为代表的多能性干细胞技术进行深入研究。
基于iPS、ES等多能性干细胞在研究人正常胚胎发生、非正常发育、发现合成药物和胚胎缺陷检测及作为细胞置换、器官移植和基因治疗，优质家畜品种培育、濒危动物保护等方面具有重要的参考、应用价值。
本研究拟利用猪这一模型，重点解决如下问题：
1确定猪iPS重编程的关键基因及其组合
通过筛选能诱导出猪iPS的转录因子组合以及直接利用现有在小鼠和人iPS上成功的诱导因子组合，进而得到猪iPS系。
而后再对猪iPS系与常规自然胚来源的猪ES系在多方面进行比较，检测经过诱导终末分化体细胞产生的猪iPS究竟和ES之间在获取效率，细胞形态、增殖特点、细胞表面特异性标志物、基因表达及表观遗传学状态上有多大相似和差异，对于深入认识去分化/分化机制很有帮助；
2检验猪iPS系生殖系转移的能力
能否成功参与嵌合体各类型细胞的发生，尤其是能否参与形成生殖系细胞，是衡量多能性干细胞发育能力的一个重要标准。
因此，本项目拟将诱导获取的猪iPS和常规猪ES注入到正常2倍体或4倍体囊胚腔内，检测、分析iPS是否参与嵌合体各类细胞，尤其是种系生殖细胞的形成；作为评价多能性干细胞发育能力更为严谨的办法，嵌合体发育对认识iPS的多能性、评估iPS安全性等方面十分关键，也对人类iPS具有十分重要的参考价值。
3研究iPS提高克隆胚的发育的能力，检验其安全性
已有研究表明，多能性干细胞做供核时，克隆效率高、后代存活率高、畸形率低。
以iPS为供核开展克隆，尝试进行转基因、基因组修饰克隆猪制备，以培育生长性能好、环境友好型、品质优良的家猪新品种，人类心血管疾病模型及为人类异种器官移植提供供体。
因此，此项研究将不仅有助于提高克隆效率，制备转基因猪，还会有助于我们更直接地了解iPS的安全性，为家畜良种培育及人类再生医学提供重要参考依据。
4研究猪体细胞重编程成为iPS的分子机制
分化的体细胞可以通过体细胞克隆、与胚胎干细胞融合、卵母细胞提取物共培养等方法发生不同程度的去分化，其间最主要的重编程事件有端粒的恢复以及表观遗传学重编程（如DNA甲基化、X-染色体失活、组蛋白修饰、染色质重塑等）。
研究表明，重编程错误或者不彻底，会直接影响体细胞能否彻底恢复发育全能性，会限制上述技术的推广应用。
因此，作为最新被建立起来能使分化的体细胞发生去分化的手段，iPS在形成过程中的重编程事件，如端粒和表观遗传学修饰的重编程是否正常，也将直接影响iPS全能性是否完全恢复。
了解这些事件，不仅能丰富我们对细胞分化/去分化机制的认识，也将能促进我们对人iPS安全性、可靠性和应用的研究。
主要研究内容
围绕着解决上述关键科学问题，重点解决猪iPS系诱导关键因子组合筛选、组合、诱导策略、诱导后发育潜能检测分析；比较猪iPS系与ES系之间生物学特性的异同，深入比较体细胞核移植与iPS这两种细胞重编程的机制、效率；尝试利用猪iPS、ES这些多能性干细胞提高核移植效率，制备普通的、转基因或者基因组修饰的克隆猪（如人类心血管疾病模型、异种器官移植器官供体猪等），探索已分化体细胞端粒和表观遗传重编程致去分化的规律及作用机制。
因此，本项目拟在课题组已有备的基因克隆与分析平台、干细胞分离建系平台、嵌合体制备与分析平台、转基因和基因组修饰技术平台、细胞核移植（克隆）平台、细胞重编程事件检测分析平台等基础上，重点研究：
1）猪iPS系诱导关键基因筛选和技术体系建立；2）猪iPS体内、体外的分化发育潜能及猪iPS的应用；3）猪iPS在形成期间的重编程的规律与机制。
1.猪多能性干细胞特异因子的分子生物学研究
①比较猪体细胞与早期胚胎、成体干细胞基因表达差异，获得猪干细胞特异因子；
②克隆猪多能性干细胞特异因子的编码基因；
③构建猪干细胞特异因子逆转录病毒载体；
④构建猪干细胞特异因子mRNA体外转录载体。
2.猪iPS系的构建
①猪iPS关键基因组合研究：
已知小鼠和人类成纤维细胞上获得成功的诱导基因组合是：
Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4;Oct3/4Sox2,Nanog,Lin28;Oct3/4,Sox2,Klf4三种组合方式；在直接采用上述三种组合方式进行实验的同时，针对猪自身在内细胞团上所表现出来的特有多潜能相关基因（有待进一步筛选）加入到上述组合中后形成其他几组实验组，共同进行基因导入和筛选实验，以期获得新的诱导基因组合；将构建好的猪干细胞特异因子逆转录病毒表达载体进行包装，转染猪胚胎成纤维细胞，建立猪iPS系，并进行鉴定；
②在获得猪iPS的研究中，将重点研究外源因子介导下细胞重编程的分子作用机制，探索改进生产iPS的技术路线，解决iPS安全性问题。
3.对照组ES系的建立
从自然繁殖囊胚、孤雌激活囊胚及猪体细胞克隆囊胚分离并建立猪的ES系。
4.猪iPS系和对照组ES系比较
比较iPS系和ES系之间在形态、增殖特性、细胞表面特异性标志物间的异同。
5.猪iPS制作嵌合体及其嵌合发育研究
选取上述实验获得的iPS制作嵌合体，然后将胚胎移植到发情同步的普通受体母猪子宫内。
观察嵌合体胚胎的体外发育及嵌合情况，经胚胎移植入受体后观察是否可以出生嵌合体猪，以及生殖系嵌合情况。
6.对照组ES系嵌合体猪
将获得的猪ES注射毛色不同猪的整胚中，嵌合囊胚转移到同期的受体猪子宫内，产出小猪后，检测嵌合体猪，分析ES形成嵌合体猪的能力，并与iPS嵌合体猪比较。
观察后代生产效率、表型、行为等方面的异同。
7．猪iPS在体内发育过程中的有效性和安全性监测
以猪ES系为对照比较猪iPS在体内发育过程中对胎儿器官生长的影响和对胎盘和母体生长的影响，监测和评估其是否会导致嵌合体猪出现遗传变异和肿瘤形成。
8.iPS体外诱导分化潜力
探索iPS体外定向诱导分化培养技术体系，观测其向三个胚层分化，包括神经，心肌，胰岛细胞等以及体外分化形成配子（精子、卵子）的能力。
9.猪iPS为供核克隆胚的生产以及发育分析
集成课题组现有成果，比较iPS来源的克隆胚与普通细胞来源的克隆胚早期发育效率，建立以iPS为供核的克隆技术平台。
10.利用猪iPS进行转基因、基因组修饰的研究
设计打靶载体，对iPS进行同源重组操作，分析打靶效率和制备克隆胚及个体的发育潜能。
11.iPS与ES之间基因组学变化的比较
对上述所获iPS与ES的细胞形态、培养条件、细胞表面特异性标志物、生长增殖特性、全基因组范围内基因表达等方面进行比较分析；同时比较二者在生产嵌合体、转基因动物方面的效果、效率是否与上述指标有相关性；
12.供体细胞在诱导后，端粒变化、端粒酶活性研究
以体细胞核移植为对照组，探讨端粒及端粒酶在成体细胞、iPS、克隆胚以及克隆后代中的变化。
端粒及相关结合蛋白（已知或未知的）在成体细胞、iPS、克隆胚及克隆后代细胞中的差异。
为研究端粒酶在iPS的功能，利用TERTRNAi干扰技术，对iPS细胞增殖及端粒功能进行分析。
端粒表观遗传改变在iPS的建立长期复制以及多能性维持中的作用，对于调节端粒长度有关的DNA甲基化酶、组蛋白乙酰化酶进行分析。
用不同方法产生的iPS及ES，对其端粒功能、端粒表观遗传及端粒酶活性进行比较研究，寻找端粒及端粒酶最正常的iPS，为iPS真正应用提供可靠理论依据；
13.猪iPS建系过程中，表观遗传学重编程事件研究
利用免疫荧光、亚硫酸盐变性测序、HPLC、ChIP、RT－PCR等技术研究DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等相关的方法，对猪iPS在诱导发生过程中的表观遗传修饰重编程跟踪检测分析，并与体细胞克隆所诱发的重编程相应事件进行比较研究。
二、预期目标
总体目标
建立获取猪iPS、ES等多能性干细胞的技术平台；揭示猪iPS、ES等多能性干细胞在嵌合体后代生殖系的遗传潜能和安全性以及体外诱导分化、发育的潜力，促进对细胞重编程机制的深入研究；取得拥有自主知识产权的新发现、新技术和新方法，建立猪iPS、ES、体细胞克隆及胚胎发育研究的国际一流基地；造就一支具有国际竞争力的，由优秀中青年科学家组成的创新团队，培养一批能独立从事高水平科学研究的后备力量，为猪iPS的建立，加快iPS在医学、畜牧业和基础研究中的应用提供科学依据。
五年预期目标
1.建立获取猪iPS系的技术方案及iPS细胞建系的工作平台，获得诱导猪iPS的关键因子及其组合，并探讨其作用机制；从猪囊胚、克隆囊胚中分离ES系；
2.揭示猪iPS、ES等多能性干细胞体内、体外分化与发育的潜能；检验猪iPS、ES等多能性干细胞分化为生殖细胞的能力；建立iPS、ES等多能性干细胞体外定向诱导分化技术平台；阐明猪iPS的安全性、有效性；
3.探讨诱导iPS和细胞核移植形成ntES这两种不同技术途径的重编程机制；
4.建立有效、经济地生产iPS、ES嵌合体猪与克隆猪等动物模型的技术程序；
5.培养研究生40名，并培养一批具有国际竞争力的优秀中青年后备人才；
6.在本领域的国际代表性学术SCI刊物上发表40余篇学术论文，其中影响因子高于5的不少于12篇。
三、研究方案
学术思路、技术途径
小鼠和人类iPS获得了成功，这是基于多年来小鼠和人类胚胎干细胞研究基础上的一个突破性成果。
然而，iPS尚处于发展的起步阶段，尤其是还有很多的不确定性安全隐患，其有效性、安全性在现有环境下，无法通过人自身来验证和克服，而利用小鼠也存在很大的局限性。
再者，到目前为止，除小鼠之外，其它物种仍没有真正意义上的ES系，iPS技术的出现无疑为其它动物的干细胞研究带来了新的希望。
同时由于小鼠和人类iPS建立过程中所采用的基因都是被证明为对维持细胞的全能性和自我更新能力密切相关的基因，而这些基因在其它动物上是否具有同样的作用呢？
这些基因作为外源基因进入到其它动物的体细胞染色体中以后是否也能够像在小鼠和人类成纤维细胞中一样诱导内源干细胞基因的表达，进而形成iPS？
如果也能够通过iPS途径获得相应的干细胞，那这种干细胞是否和小鼠的ES、iPS一样具有形成生殖系嵌合体的能力？
iPS是否可以在体外经定向诱导分化形成特定的细胞类型？
这些问题我们目前还无法回答。
猪属哺乳纲、偶蹄目、猪科。
猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人的情况极其相似，猪的体型大小和驯服习性允许进行反复采样和进行各种外科手术。
另外，其基因多样、繁殖周期短、生产力高，一窝产仔多，便于根据特殊需要进行选育。
因此，长期以来，猪就被认为是开展人类医学临床前试验的最佳模型，如猪可以用作皮肤烧伤、肿瘤、免疫学、糖尿病、畸形学和产期生物学、遗传性和营养性疾病等医学研究的动物模型。
因此，本研究拟利用这一特色动物模型，开展iPS建系及分化发育研究，相信在通过本科学研究回答上述问题的过程中一定会带来更多的新发现，而这些发现一定会对人iPS安全性、有效性以及干细胞的特性、形成和维持机理等理论问题研究起到巨大的推动作用。
本项目拟利用诱导多能干细胞技术和生殖系嵌合技术，获得猪的iPS嵌合体和体细胞克隆后代，并研究不同重编程技术获得的克隆胚胎和个体的发育及生长特性。
将细胞生物学、分子生物学和发育生物学，与基因组学、蛋白质组学、表观基因组学、系统生物学以及其他最新的研究手段相结合，深入探讨1）猪iPS系诱导关键基因筛选和技术体系建立；2）猪iPS体内、体外的分化发育潜能及猪iPS的应用；3）猪iPS在形成期间的重编程的规律与机制。
进一步拓展iPS的研究领域，为深入了解细胞核重编程去分化，促进克隆效率的提高和应用于畜牧良种，医学模型及异体器官培育等提供依据。
各课题之间的关系如下图所示。
创新性与研究特色
考虑到猪等动物与小鼠和人类之间的差异，尤其是在胚胎干细胞获取的过程中所存在的差异，很可能猪的干细胞形成和维持的关键基因与小鼠和人类之间存在较大的差异，因此本研究项目在完全采用小鼠和人类iPS成功的三种基因组合方式之外，还提出了新的基于猪ICM细胞全能性物种特异基因的方案，同时还提出了基于猪类ES基础上的iPS路线，以及通过干细胞形成与维持基因产物的直接培养模式。
尤其是在目前，人iPS还存在很多不确定的安全隐患、有效性无法在人自身开展验证，利用猪这一人类最佳模型动物，研究iPS在诱导形成期间的重编程机制，全面评估其安全性、有效性，具有非常明显的创新性和引导性。
通过这些尝试非常可能带来关于干细胞理论方面的重大突破，有利于人类对干细胞的深入了解，也同时可以促进干细胞早日应用到人类的医疗事业上。
本项目的申请单位由多家构成，分别具有基因获取、载体构建、干细胞培养、胚胎嵌合体构建、核移植胚胎构建等方面的研究优势，而且在各自的领域内都处于国内领先地位，具有非常强的科研国际竞争力，将这些研究机构的优势综合到这个研究项目中可以达到真正的强强联合，发挥各自的优势，快速的推进该项研究进展的目的，解决困扰iPS的关键问题。
取得重大突破的可行性分析
本项目的总体方案是切实可行的。
本项目提出的主要科学问题和研究目标不仅具有理论和实际依据，而且都是该领域前沿性和关键性的问题。
队伍和组织机构：
本项目严格按照“重大科学研究计划”申报要求，坚持合作、互补、多赢、负责的态度，联合了在该领域取得突出成绩的国内优秀中青年科学工作者。
他们都是经历了在国外相关领域知名实验室从事科学研究，学成回国的年富力强的科研人员，也都有参加过国家重大、重点课题项目的经历，具备承担国家项目并取得重要突破的素质。
研究课题组成员有深厚的理论知识与丰富的实践经验,熟悉当前的研究现状及方法手段,对本课题的研究具有较强的掌控及应变能力,能保证课题的顺利完成。
承担单位有良好的研究条件和研究基础，并已具备了相当规模并取得了很好的科研成果，已具备的条件和研究优势将保证本课题的顺利实现和圆满完成。
有国家重点实验室、211工程实验室、985科技创新平台以及省部级重点实验室等，本研究所涉及的仪器设备和材料均有保障。
已经在克隆领域获得了国内外瞩目的成果：
项目参与单位的主要人员近年来都在猪的体细胞克隆、家畜多能性干细胞、模式动物胚胎干细胞和成体干细胞应用及基础研究方面获得过成功，尤其是国际首例克隆大鼠、雪貂、α-1，3半乳糖苷转移酶敲除克隆猪、克隆动物端粒恢复，国内首例体细胞克隆猪、国内首例转基因体细胞克隆猪、国际首例手工克隆猪等均在国内外倍受关注。
总之，上述条件将为本课题的顺利完成提供坚实的基础和物质、智力保障。
项目的组织
本项目以南开大学、吉林大学、西北农林科技大学、中国农业大学为主体四个单位申报，与中国科学院等单位密切合作。
围绕总体战略目标，本项目设立四个课题组，研究过程中紧密配合、优势互补，并提倡资源共享。
本项目的执行采用首席科学家负责制，首席科学家将充分发挥课题负责人和学术带头人的领导作用，采用学科交叉、分工合作的方式来实施研究计划。
同时，首席科学家将在相关部门的领导下，根据国家规定，通过项目专家委员会，采用激励和滚动机制对项目进行管理，保证研究计划的稳步顺利实施。
课题设置、各课题间的相互联系以及与项目预期目标的关系
依据项目拟解决的关键科学问题、研究重点和预期目标，为了有效组织研究力量、围绕主攻目标、发挥学科交叉、优势互补作用，将总任务分解为4个课题：
1）猪iPS系和ES系的建立；2）猪iPS体内分化与发育能力、安全性监测；3）猪iPS体外分化与发育能力分析；4）iPS发生期间的体细胞重编程规律与分子机制。
通过课题1可以初步了解猪iPS诱导的关键因子、技术策略，并通过与对照组ES在生长、增殖特性及细胞表面标志物等之间的比较，获得可靠的iPS系；而通过课题2研究结果，可以得知iPS在体内的分化与发育潜能，揭示iPS究竟能否参与生殖系的遗传，在嵌合体后代中能参与形成那些组织器官等；同时通过课题3的研究，可以了解iPS在体外诱导分化处理后，能否形成配子、神经细胞以及其它类型的细胞，以及做为核移植供体生产克隆猪的效率、发育命运等；课题2和课题3是课题1的延伸，通过这两个课题可以评价猪iPS的安全性、有效性，最后，结合课题4比较体细胞在历经iPS以及核移植这两种不同的重编程技术处理之后，在分子水平上的异同，全面评估iPS的安全性、有效性；4个课题相互补充，共同构成一个完整的研究思路。
（一）、猪iPS系和对照组ES系的建立
研究目标:
建立获取猪iPS系的技术方案，获得诱导猪iPS的关键因子组合，并探讨其作用机制；与从自然繁殖囊胚、克隆囊胚中分离建立ES系作比较。
培养研究生12名，发表SCI论文12篇。
研究内容:
1.猪多能性干细胞特异因子的分子生物学研究
筛选出猪干细胞特异因子；克隆这些特异因子的编码基因并构建逆转录病毒载体以及体外转录载体。
2.猪iPS系的构建
猪iPS关键基因组合研究：
直接采用oct3/4，sox2，c-myc，klf4；oct3/4sox2，nanog，lin28；oct3/4，sox2，klf4三种组合方式进行实验的同时，将上述筛选获得的特异因子加入到上述组合中后形成其他几组实验组，共同进行基因导入和筛选实验，以期获得新的诱导基因组合；将构建好的猪干细胞特异因子逆转录病毒表达载体进行包装，转染猪胚胎成纤维细胞，建立猪iPS系，并进行鉴定；在获得猪iPS的研究中，将重点探索改进生产iPS的技术路线，解决iPS安全性问题。
3.对照组ES系的建立
从猪囊胚的内细胞团分离并建立猪的ES系。
4.猪iPS系和对照组ES系比较
对iPS系和ES系的形态、增殖特性以及细胞表面特异性标志进行比较分析。
承担单位：
吉林大学
课题负责人：
李子义
学术骨干：
赖良学、欧阳红生
经费比例：
29%
（二）、猪iPS体内分化与发育能力、安全性监测
研究目标:
揭示猪iPS、ES等多能性干细胞体内分化与发育的潜能；发现猪iPS、ES等多能性干细胞参与生殖系遗传的能力，建立生产iPS、ES嵌合体猪动物模型的技术程序，初步揭示猪iPS的安全性、有效性。
培养研究生10名，发表SCI论文10篇。
研究内容:
1.猪iPS制作嵌合体及其嵌合发育研究
制作iPS嵌合体，并观察嵌合体胚胎的体外发育及嵌合情况，检测iPS的生殖系嵌合能力；
2.对照组ES系嵌合体猪
将获得的猪ES注射到毛色不同的猪整胚中，分析ES形成嵌合体猪的能力，并与iPS嵌合体猪比较；观察后代生产效率、表型、行为等方面的异同。
3．猪iPS在体内发育过程中的有效性和安全性监测
以猪ES系为对照，比较猪iPS在体内发育过程中对胎儿器官生长的影响和对胎盘和母体生长的影响，监测和评估其是否会导致嵌合体猪出现遗传变异和肿瘤形成。
承担单位：
西北农林科技大学
课题负责人：
王华岩
学术骨干：
刘忠华
经费比例：
20%
（三）、猪iPS体外分化与发育能力分析
研究目标:
揭示猪iPS、ES等多能性干细胞体外分化与发育的潜能；建立iPS、ES等多能性干细胞体外定向诱导分化技术平台，建立生产iPS、ES克隆猪等动物模型的技术程序；初步阐明猪iPS做为体细胞核移植供体的有效性。
培养研究生14名，发表SCI论文10篇。
研究内容:
1.iPS体外诱导分化潜力；
探索iPS体外定向诱导分化形成配子（精子、卵子）的能力。
2.猪iPS为供核克隆胚的生产以及发育分析；
比较iPS来源的克隆胚与普通细胞来源的克隆胚早期发育效率，建立以iPS为供核的克隆技术平台。
3.利用猪iPS进行转基因、基因组修饰的研究
设计同源重组打靶载体，对iPS进行转染，分析打靶效率和制备克隆胚及个体的发育潜能。
承担单位：
中国农业大学
课题负责人：
韩建永
学术骨干：
NathalieBeaujean
经费比例：
24%
（四）、iPS发生期间的体细胞重编程规律与分子机制
研究目标:
获得猪iPS生物学特性完整数据，包括：
获得iPS端粒及表观遗传学重编程特征；探明供体细胞在经历iPS和体细胞核移植这两种不同的细胞重编程技术处理之后，其重要的生物学特性与重编程规律及分子机制。
培养研究生10名，发表SCI论文12篇。
研究内容:
1.iPS与ES之间基因组学变化的比较
iPS与ES全基因组范围内基因表达等之间进行比较分析；同时比较二者在生产嵌合体、转基因动物方面的效果、效率是否与上述指标有相关性；
2.供体细胞在诱导后，端粒变化、端粒酶活性研究
探讨端粒及端粒酶在成体细胞、iPS、克隆胚以及克隆后代中的变化；对iPS细胞增殖及端粒功能进行分析；用不同方法产生的iPS及ES，对其端粒功能、端粒表观遗传及端粒酶活性进行比较研究，寻找端粒及端粒酶最正常的iPS，为iPS真正应用提供可靠理论依据。
3.猪iPS建系过程中，表观遗传学重编程事件研究
深入研究iPS和体细胞克隆这两种细胞重编程技术中所涉及的DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等事件。
承担单位：
南开大学
课题负责人：
刘林
学术骨干：
张运海、陈凌懿、张晓东
经费比例：
27%
四、年度计划
研究内容
预期目标
第
一
年
1.采用不同转录调控因子组合诱导猪iPS细胞，建立iPS细胞系；
2.对照组ES系的建立；
3.对上述得到的猪iPS细胞和ES细胞进行系统的细胞和分子生物学检测；
4.猪iPS多潜能性的鉴定；
5.检测成体细胞以及诱导形成的iPS细胞的端粒长度以及端粒酶活性。
1．获得猪iPS诱导的最佳细胞因子组合，获得2-4株猪iPS细胞系；
2．优化猪ES细胞系；
3．了解iPS细胞的端粒长度以及端粒酶活性；
4．发表3～4篇SCI论文。
第
二
年
1．采用显微操作技术，生产iPS嵌合体猪，利用特定iPS细胞标记，进行功能基因和微卫星DNA检测；
2．比较iPS嵌合猪与ES嵌合猪产出的仔猪后代生长发育情况，对比分析iPS形成嵌合体猪的能力；
3．探索猪iPS体外定向诱导分化、培养技术体系，观测其向三个胚层分化能力，包括猪iPS体外定向诱导分化形成神经、心肌、胰岛细胞等；
4．比较iPS与ES功能基因组表达差异，同时比较二者在生产嵌合体、转基因动物方面的效果、效率是否与上述指标有相关性。
1．化并获得猪iPS诱导成为神经细胞、心肌细胞和胰岛细胞的细胞诱导因子组合及建立体外诱导分化技术体系；
2．获得来源于猪iPS以及取猪iPS的猪成体细胞为核供体的克隆囊胚；
3．比较得到iPS与ES细胞的异同。
并且比较分析其体外发育的能力；
4．发表7～9篇SCI论文。
第
三
年
1．对iPS细胞的F1或F2代仔猪进行遗传学分析检测，检测iPS细胞是否具有生殖系嵌合能力；
2．探索猪iPS体外定向诱导分化形成具有功能性配子的
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