土壤中淀粉酶产生菌的筛选.docx
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土壤中淀粉酶产生菌的筛选
微生物实验报告——馒头、圣女果及柚子皮上产淀粉酶的微生物的筛选
班级:
姓名：
学号：
指导老师：
一、实验目的
1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
2.练习微生物接种、移植和培养的基本技术。
3.学习并掌握分离纯化微生物的基本操作。
二、实验原理
芽孢杆菌（Bacillaceae），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。
包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。
它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。
芽孢杆菌bacillus杆菌科的一属能产生淀粉酶的细菌。
我们小组利用芽孢杆菌能够分解淀粉酶的特征，从柚子皮、圣女果、馒头上分离芽孢杆菌，并取得良好的效果。
在本次试验中，我们将柚子皮、圣女果、馒头上收集了菌种进行培养、分离、纯化、鉴定，最后利用产淀粉酶的菌种与碘液能产生水解圈，并对能产生水解圈的菌种进行革兰氏染色观察、芽孢观察等。
此外，选择芽孢杆菌进行试验还取决于它的特性：
1.繁殖快速：
代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。
2.生命力强：
无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。
3.体积大：
体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。
芽孢是休眠体，不是繁殖体。
绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内,由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。
在显微镜下进行芽孢观察时，还应注意染色问题。
三、实验仪器及药品
1．样品：
馒头、圣女果、柚子皮
2．培养基：
牛肉膏蛋白胨淀粉培养基
3．溶液和试剂：
0.5%番红染液、5%孔雀石绿染液、95%乙醇、1%结晶紫染液、卢戈氏碘液、蒸馏水等。
4．仪器和其他用品：
酒精灯、试管、三角瓶、培养皿、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、试管夹、镊子、滤纸、滴管等。
四、实验步骤
1.产淀粉酶微生物的培养：
将馒头在28℃温箱中与少量土壤混合培养。
将变质圣女果继续培养至能肉眼可见菌落。
将霉变的柚子皮放入28℃温箱中继续培养。
2.灭菌消毒：
将洁净的试管20支，平板25个，三角瓶两个包扎并于121℃、0.1MPa下用高压灭菌锅灭菌。
3.制作平板：
采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板。
4.划线接种：
（由于圣女果，馒头，橘皮上长出菌株较少，所以我们采用直接接种）分别将馒头、圣女果、橘皮上生长的菌落用分区划线法分别接种到六个平板的上。
5.鉴定水解圈：
将上述培养基培养24小时后，将其取出，将平板上的菌落用牙签挑到另一个洁净的平板培养基上。
然后用卢戈式碘液检验，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有透明的水解圈，说明该菌能分解淀粉，即能产生淀粉酶。
将事先接种的平板标记并培养。
6.纯化：
将能产生水解圈的菌种用无菌操作法接种到斜面上。
7．培养：
将上述斜面培养24小时。
8．鉴定一：
将其中一管斜面先用革兰氏染色法染色，看其为革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌。
记录其形态。
①涂菌及固定：
在干净载玻片上滴一滴蒸馏水，通过无菌操作用接种环涂菌在载玻片上，等其自然干燥后，在酒精灯火焰上过二至三次。
②初染及冲洗：
滴一至两滴结晶紫，染色1分钟。
然后开小股水流冲洗载玻片至流出的水无色为止。
③媒染及冲洗：
滴一至两滴卢戈氏碘液，染色1分钟。
然后按上述方法冲洗载玻片至流出来的水无色为止。
④脱色及冲洗：
滴加95%的乙醇溶液，脱色15—18秒。
同上方法冲洗载玻片。
⑤复染及冲洗：
滴加一至两滴番红染液，染色2分钟。
同上方法冲洗载玻片。
⑥镜检：
在显微镜下仔细观察，记录结果。
9.鉴定二：
再过24小时（即斜面培养48小时）后，即可进行芽孢染色鉴定。
（加热染色和改良法）
加热染色法：
①涂菌及固定：
在干净载玻片上滴一滴蒸馏水，通过无菌操作用接种环涂菌在载玻片上，等其自然干燥后，在酒精灯火焰上过二至三次。
②加热染色：
向载玻片上滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用镊子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持10分钟，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。
③复染及冲洗：
用0.5%番红水溶液复染2分钟。
用小股自来水冲洗载玻片至流出来的水无色为止。
④镜检：
将载玻片晾干后油镜镜检。
改良法：
1制备菌液：
加水2至3滴于小试管中，用接种环从斜面上挑取较多的菌于试管中，充分混匀，使成较浓的菌液。
2加染料：
加5%孔雀绿液（约0.3-0.4ML）于试管中，充分混合。
3加热：
将此试管浸于沸水浴中，加热15-20分钟。
4涂片及固定：
从试管中携菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜。
并在微火上过3次。
5冲洗：
用小股水流冲洗至流出来的水无色为止。
6复染：
用番红溶液复染1分钟。
7倾去染液后，用吸水纸吸干。
然后镜检。
五．实验结果
1、在第二次倒平板时，圣女果和馒头组分别出现了明显的水解圈，而柚子皮的则没有。
圣女果上的菌体水解圈
馒头上的菌体水解图
柚子皮上的菌体无水解圈
1、在用斜面上的菌进行革兰氏染色（沙黄和番红）的过程中发现：
（1）圣女果斜面：
有呈蓝紫色杆状和粗杆状的细菌，也有呈红色的杆状菌体。
（2）馒头斜面：
呈红色的杆状菌。
2、从圣女果的第一个斜面提纯以后再进行革兰氏染色，发现呈红色长杆状细菌。
3、芽孢观察
（1）圣女果的第二次斜面（提纯）组：
有绿色的芽孢，红色的呈杆状细菌。
（2）馒头的第一次斜面（改良法）：
有少量芽孢，呈绿色。
六．分析与讨论
实验前期，由于馒头上长时间无菌种，我组将土壤与馒头混合培养以获得菌种。
而圣女果上已有黑色与白色两种形态不同的菌种，但菌种较少，所以我们采用了直接接种，而不是梯度法稀释。
这样造成了首次接种菌落不纯的后果。
但我们鉴定出能产淀粉酶的菌株后采用多次接种纯化，最终得到了菌种较纯的斜面与平板。
实验鉴定时由革兰氏染色鉴定出所选菌株有阴性菌也有阳性菌，但纯化得到得菌种从外形上观察为杆菌。
初步判断为芽孢杆菌，鉴定芽孢杆菌时选用了两种方法，一是老式的芽孢鉴定法，二是改良的芽孢鉴定法。
都鉴定出了产芽孢的杆菌。
通过本次试验，我们学会了初步提取并鉴定目标菌种的方法。
该实验要求我们具有团结互助的实验精神和熟练的实验操作技术。
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