琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA.docx
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琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
琼脂糖凝胶电泳鉴定
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差100的片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段。
普通琼脂糖凝胶分离的范围为0.2-20，利用脉冲电泳，可分离高达10^7的片段。
琼脂糖凝胶电泳操作流程
准备干净的配胶板和电泳槽
注意酶污染的仪器可能会降解，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
选择电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
正确选择凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有和，而比有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，值上升，缓冲性能下降，可能使电泳产生条带模糊和不规则的带迁移的现象。
电泳的合适电压和温度
电泳时电压不应该超过20，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的电泳，温度应该低于15℃。
注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象
样品的纯度和状态
是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。
乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。
注意变性的样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的条带迁移。
在上样前不要对样品加热，用20缓冲液稀释可以防止变性。
的上样
正确的上样量是条带清晰的保证。
注意太多的上样量可能导致带型模糊，而太小的上样量则导致带信号弱甚至缺失。
公司分子量标准每次上样6即可得到清晰均匀的条带。
的选择
电泳一定要使用或已知大小的正对照来估计片段大小。
应该选择在目标片段大小附近较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。
公司的条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。
需要注意的是的电泳同样也要符合电泳的操作标准。
如果选择λ或者λ的酶切，需要预先65℃加热5，冰上冷却后使用。
从而避免或酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。
凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。
而其他系列例如，，虽然毒性小，但价格昂贵。
公司的相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统染料高10倍以上。
注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。
实例实验：
一、实验原理
用于分离，纯化和鉴定的凝胶电泳有二类，一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于1和大于1以上；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用小于1的。
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便，快速分离、纯化和鉴定的方法，已广泛应用于核酸研究中。
在琼脂糖凝胶中迁移率和凝胶浓度、分子大小、分子的构象及电泳电压密切相关。
染色采用溴化乙锭（），在紫外钱照射下的发射荧光。
能插入分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍。
荧光的强度正比于的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。
二、试剂：
1．电泳缓冲液：
40（8.0）
20
2
配制方法：
先配50倍电泳缓冲液，用时取5，重蒸水稀释至250。
50倍电泳缓冲配制方法：
121.1g
无水
41.0g
·2
18.6G
先用400重蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调节至8.0（大约25毫升）然后加蒸水定容至500。
1.12灭菌20分钟。
2．溴酚蓝指示剂：
称取溴酚蓝200，加重蒸水10，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖50g，加蒸馏水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至100，加101～2滴，调至蓝色。
3．：
（10溴化乙锭）
配制方法：
溴化乙锭
1g
2O
100
4．琼脂糖
三、仪器
1．微波炉
2．电泳仪
3．手提式紫外检测仪
4．电泳槽
四、实验方法
1．制备琼脂糖凝胶：
称取琼脂糖0.105g，溶解在15电泳缓冲液中，置微波炉中至琼脂糖溶化均匀。
2．灌胶：
将电泳槽载胶板两侧用透明胶布或医用胶布密封好，防止灌胶时出现渗漏。
然后在凝胶溶液中加3μl，摇匀。
插好点样梳子，轻轻倒入电泳槽载胶板中。
除掉气泡。
3．待凝胶冷却凝固后，轻轻取出点样流，将电泳槽载胶板两侧封胶用的透明胶布或医用胶布撕下。
4．点样：
提取的质粒样品液8μ1.6μl溴酚蓝指示剂，混匀、点样。
记录点样次序及点样量
5．在电泳槽中加入电泳缓冲液，将点好样的载胶板轻轻放在电泳槽内。
6．电泳：
接上电极线，点样侧接电泳仪负极，蝇一侧接电泳仪正极，50V电泳45至60分钟。
7．将电泳槽载胶板拿到暗室，在紫外灯下直接观察结果。
五、说明
1．在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率与凝胶浓度、分子大小、分子构象及电泳电压有关。
（1）凝胶浓度根据待分离分子的大小，选择凝胶中琼脂糖的含量（凝胶浓度）。
琼脂糖的含量（％）
分离线状分子的有效范围（）
0.3
60－5
0.6
20－1
0.7
10－0.8
0.9
7－0.5
1.2
6－0.1
1.5
4－0.2
2.0
3－0.1
（2）分子大小线状双链分子在一定浓度凝胶上电泳的迁移率与线性双链分子的分子量对数成反比。
（3）分子的构象线状双链分子在一定浓度琼脂糖凝胶中有泳动距离与的分子量对数成反比。
但当分子处于不同构象时，它在电场中移动的距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。
有相同分子量的线状、开环状（超螺旋为O）和超螺旋在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的。
高度超螺旋的移动速度最快，随着超螺旋程度降低，相应的移动速度依次变慢，最慢者为线状双链。
例如40病毒处于高度超螺旋状态，电泳速度最快，经拓扑异构酶作用产生不同程度的超螺旋在凝胶电泳时，按不同速度在胶上移动而形成多条带。
了解这一点对分析电泳图谱至关重要。
当用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒纯度时，发现凝胶上有数条带，难以确认是由于质粒本身存在着超螺旋引起的，还是因为含有其他引起的可采用下述方法鉴定。
从琼脂糖凝胶上将带逐个回收，用同一种限制性内切酶切，然后在琼脂糖凝胶上电泳，如果在凝胶上出现相同的图谱，则说明它们是处于不同超螺旋状态的同一种。
（4）电源电压低压条件下，线状在琼脂糖凝胶上泳动速度和电压成正比。
随着电压升高，高分子量的片段泳动速度和电压不成正比关系，分辨率下降了，因此为了得到良好的分离效果，电场电压不要超过5。
2．琼脂糖凝胶电泳图谱分析离不开紫外分析灯，可是紫外光对分子有切割作用。
从胶上回收供重组同时，避免紫外光切割是非常重要的，尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯（300～360）可减少紫外光切割。
3．溴化乙锭（）染色：
溴化乙锭是核酸的染色剂，在水平式琼脂凝胶电泳中，对的染色，一般有三种做法。
（1）在制胶中与电泳缓冲液中同时加入0.5μ的。
（2）只在胶中加入0.5μ的，而在电泳缓冲液中不加，这就减少了操作时双手受污染的机会，而且区带也清晰可见。
这是目前绝大多数实验使用的方法。
（3）在电泳结束以后，取出琼脂糖产凝胶，放在含有0.5μ的电泳缓冲液（或2O）中染色40分钟。
如果天气寒冷，琼脂糖浓度高凝胶板厚也可在37℃保温染色或轻微振荡染色。
也可采用加大的剂量（1μ）或延长染色时间。
比较3种使用方法，采用
（1）与
（2）可与实验过程中随时的迁移情况，极为方便。
但是
（1）的操作更需小心，防止实验用具及台面的污染。
所以一般选用
（2）。
（3）的好处是电泳过程中保持本来的状态，有利于凝胶图谱分析，更能准确地测定分子量。
因为在凝胶中有时，一定量插入就会使双链线状的迁移速度下降。
是强致癌剂，因此使用过程上要注意戴手套，及时用高锰酸钾处理污染物。
具体的方法如下。
（1）加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5以下。
（2）加入1倍体积的0.54，小心混匀后再加1倍体积的2.5。
小心混匀，于室温放置数小时。
（3）加入1倍体积的2.5，小心混匀后可丢弃该溶液。
以前曾广泛采用的用次氯酸处理溴化乙锭稀溶液的方法，效果不好。
此外，溴化乙锭在262℃分解在标准条件下焚化后也不再具有危害性。
4．溴酚蓝指示剂：
常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度，也可以利用其迁移率大致估计的分子量。
溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关，以0.5×作电泳缓冲液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300的双链线状相同，而二甲苯青的泳动则与4的双链线状相同。
在琼脂糖浓度为0.5～1.1%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著，但在聚丙烯酰胺凝胶中其对应关系受凝胶浓度影响较大（详见附录表三）。
此外蔗糖使样品密度增大，使样品在点样时沉于点样孔底部，不扩散。
上样缓冲液一般配成6倍的，加样时，加入点样量的1/6即可。
《分子克隆实验指南（第三版）》419页当当网可以买到，最好依照书上的配方，因为我可能打错了
丙烯酰胺浓度 有效分离范围 二甲苯氰 溴酚蓝
3.5 1000~2000 460 100
5.0 80~500 260 65
8.0 60~400 160 45
12.0 40~200 70 20
15.0 25~150 60 15
20.0 6~100 45 12
（'-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30）
（染料一行列出的数字意思是：
染料在此浓度胶里，与此大小的双链迁移率相同）
制备1*中不同浓度聚丙烯酰胺凝胶所用试剂
丙烯酰胺凝胶，29%丙烯酰胺加1'-亚甲双丙烯酰胺，水，5*，10%过硫酸铵
3.5， 11.6， 67.7，20.0，0.7
5.0， 16.6， 62.7，20.0，0.7
8.0， 26.6， 52.7，20.0，0.7
12.0， 40.0， 39.3，20.0，0.7
20.0， 66.6， 12.7，20.0，0.7
（和水的体积可以调整，根据电泳液所用的浓度。
）
6*载样缓冲液
类型，配方， 贮存温度
1，0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰、40%（）蔗糖水溶液， 4度
2，0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰、15%聚蔗糖（400，）水溶液，室温
3，0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰、30%甘油水溶液， 4度
4，0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液，
电泳缓冲液、染料和凝胶加样液的配置
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电泳缓冲液
50×乙酸（）缓冲液
成分及终浓度配制1L溶液各成分的用量
2碱
1乙酸
100
水242g
57.1的冰乙酸（17.4）
200的0.5（8.0）
补足1L
5×硼酸（）缓冲液
成分及终浓度配制1L溶液各成分的用量
445碱
445硼酸盐
10
水54g
27.5g硼酸
20的0.5（8.0）
补足1L
染料
1％溴酚蓝（）
加1g水溶性钠型溴酚蓝于100水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。
1％二甲苯青（）
溶解1g二甲苯青于足量水中，定容到100。
10的溴化乙锭（）
小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。
用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。
凝胶上样液（）
6×碱性凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度配制10溶液各成分用量
0.3N氢氧化钠
6
18％聚蔗糖（400型）
0.15％溴甲酚绿
0.25％二甲苯青
水30010N氢氧化钠
1200.5（8.0）
1.8g
15
25
补足到10
6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度配制10溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝
0.15％二甲苯青
5
15％聚蔗糖（400型）
水1.51％溴酚蓝
1.51％二甲苯青
1000.5（8.0）
1.5g
补足到10
6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度配制10溶液各成分用量
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯青
15％聚蔗糖（400型）
水2.51％溴酚蓝
2.51％二甲苯青
1.5g
补足到10
6×甘油凝胶上样液（4℃贮存）
成分及终浓度配制10溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝
0.15％二甲苯青
5
50％甘油
水1.51％溴酚蓝
1.51％二甲苯青
1000.5（8.0）
3
3.9
6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度配制10溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝
0.15％二甲苯青
5
40％聚蔗糖
水1.51％溴酚蓝
1.51％二甲苯青
1000.5（8.0）
4g
补足到10
10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度配制10溶液各成分用量
0.2％溴酚蓝
0.2％二甲苯青
200
0.1％
50％甘油
水20
20
40.5（8.0）
10010％
5
补足到10
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