上海交通大学分子生物学技术综合实验讲义.docx

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上海交通大学分子生物学技术综合实验讲义

分子生物学技术综合实验讲义

上海交通大学生命科学技术学院

2004年11月

说明

本实验讲义是在接受了去年实验的成功经验和失败的教训的基础上编写的。

实验的名字叫“分子生物学技术综合实验”，原来是想把它设计成一个彼此连贯、前后呼应的系列实验。

但由于经费和条件的限制，还是放弃了这个念头。

实验分成两个部分：

前一部分是DNA的操作，主要是DNA片段的亚克隆的方法；后一部分是蛋白的操作，主要是凝胶电泳和免疫杂交。

两个部分的分量大致相当，但后一部分做起来对学生的收获可能更大些，因为很少有本科生能一个人原原本本地亲手做一做免疫印迹实验的。

它的操作虽然并不复杂，但成本却很高，特别如果使用的是从公司购买的抗体的话。

实验讲义在文字上，主要参考了魏群主编的《分子生物学实验指导》，而在实质内容上，DNA操作部分更多的是参考了萨姆布鲁克等人的《基因克隆》第二版的中译本，蛋白质部分主要是根据自己平日工作的积累。

希望同学们能够珍惜这次机会，认真地做实验，真正地掌握些实实在在的实验操作技能，为今后的学习和工作打下基础。

千万不要忽视实验技能的培养和提高，生物学的成就毕竟主要是通过实验干出来的。

上海交大生命学院孙群

2004年11月

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

[实验原理]（供参考，试剂盒的SolutionSS成分未知）

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

其原理是：

在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。

转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。

42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。

将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp抗性）得到表达。

然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1．小型高速离心机

2．恒温摇床

3．恒温箱

4．-20℃冰箱

5．恒温水浴器

（二）材料

1．氨苄青霉素

2．大肠杆菌DH5

3．pUC19

4．1.5mL离心管

5．枪头、枪

6．试管、培养皿

（三）试剂

1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）

2．LB培养液

在950mL去离子水中加入：

胰蛋白胨（tryptone）10g

酵母提取物（yeastextract）5g

NaCl10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。

3．氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg／mL溶液，置-20℃冰箱保存。

[实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于2mLLB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。

2．取50L菌液转接到一个含有5mLLB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。

以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。

3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的SolutionSS。

在冰上小心地用1mL枪头将细胞悬浮起来。

注意：

1mL的取液器设定在500L。

悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。

4．将上述细胞分装于1.5mL离心管（离心管要在放在冰上预冷）中，每管0.1mL。

细胞可以立即使用或储存。

5．将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。

注意：

在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。

转化：

1．新鲜制备的或-20℃下保存的100L感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2．加入5LpUC19质粒，DNA浓度为10pg/L，轻轻混匀。

3．冰上放置30分钟。

4．42℃水浴热激60秒。

5．冰上放置2分钟。

6．加400LLB培养液，37℃250转／分振荡培养30分钟。

7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400L上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。

8．将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上。

9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。

[实验结果]

经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。

计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每g质粒DNA转化的菌落数表示。

实验二质粒DNA的提取

[实验原理]

碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1．恒温培养箱

2．恒温摇床

3．小型高速离心机

4．高压灭菌锅

（二）材料

1．带有pQE-31质粒和pUC18-CAT质粒的两株大肠杆菌

2．1.5mL离心管

3．枪头、枪

（三）试剂

质粒小量制备试剂盒（3SSpinplasmidMIniprepKitV3.1,申能博彩公司）

试剂盒的参考配方:

SolutionI

50mmo1／L葡萄糖

5mmo1／L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0）

1.0mmo1／L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

SolutionII

0.4mo1／LNa0H，2％SDS（十二烷基硫酸钠），用前等体积混合

SolutionIII

5mo1／L醋酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

TE缓冲液

10mmo1／LTris·HCl

1mmo1／LEDTA（pH8.0）

胰RNA酶（RNA酶A）

将RNA酶溶于10mmo1／LTris·HCl（pH7.5）、15mmo1／LNaCl中，配成10mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

[实验步骤]

（一）提取质粒

将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE-31质粒和pUC18-CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

以下的操作按试剂盒的说明书进行。

（附试剂盒说明书）

（二）质粒的琼脂糖凝胶电泳

将5L洗脱液与3L的DNA样品缓冲液混合，加于1.2%Agarose做凝胶电泳分析。

附：

试剂盒说明书

3SSpinPlasmidMiniprepKitV3．1

上海申能博彩生物科技有限公司

bbst＠shl63．net

试剂盒组成：

组成

K1910（50次）

K1920（100次）

K1930（250次）

SolutionI（a）

5m1

10m1

25m1

SolutionII（b）

10m1

20m1

50ml

Solutionlll

20m1

50m1

2x50m1

WashSolution（c）

22m1

2x22m1

5x22m1

TE（d）

5m1

10m1

40m1

3SColumn

50支

100支

250支

Co11ectiontube

50支

100支

250根

说明书

1份

1份

l份

注：

a）SolutionI内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。

b）温度低时，SoluionII有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。

c）首次使用前，必须在WashSolution瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。

每次使用后将瓶盖旋紧，以保持WashSolution中的乙醇含量。

d）TEpH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。

抽提测序用质粒需要用水洗脱。

主要特点：

●采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。

●经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。

●无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。

●质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。

实验操作步骤（从细菌中抽提质粒）

1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。

2．加入100lsolutionI，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。

注意：

对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；

质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。

3．加入200lSolutionII，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置（2分钟左右）至溶液变成澄清。

4．加入400lSolutionIII，立即上卜颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。

注意：

步骤2和3在冰上操作效果更佳。

5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。

无需低温离心。

注意：

提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。

6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到（吸或倒入）3S柱里。

盖上离心管盖子（盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子），室温放置2分钟（室温放置时间不重要，可长可短）；用台式离心机室温高速（12，000转／分钟）离心1分钟。

注意：

转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现GenomicDNA和蛋白质污染。

离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。

7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700lWashSolution到3S柱，离心1分钟。

8．重复步骤7一次。

9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。

10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加50lTE或水，不要盖上离心管盖,室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。

注意：

将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。

测序用质粒用30l预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。

11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。

lml过夜培养细胞，质粒如果用50l水洗脱，通常情况下可以取10l洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。

实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳

[实验原理]

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。

一般提取的质粒有3种构型：

超螺旋的共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA），开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，（opencircularDNA，简称ocDNA），线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂（linearDNA，简称LDNA）。

由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1．恒温培养箱

2．琼脂糖凝胶电泳系统

3．小型高速离心机

4．高压灭菌锅

5．紫外核酸检测仪

（二）材料

1．pQE-31和pUC18-CAT质粒

（三）试剂

1．50xTAE（50倍体积的TAE贮存液）

配1000mL50xTAE：

Tris242g

冰醋酸57mL

0.5mol／LEDTA200mL

pH8.0

2．凝胶加样缓冲液（6x）

溴酚蓝0.25％

蔗糖40％

3．琼脂糖

4．溴化乙锭溶液（EB）0.5µg／mL

5．250bpDNA分子量标准

[实验步骤]

（一）制备琼脂糖凝胶

根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度％线性DNA的有效分离范围／kb

0.35—60

0.61—20

O.70.8—10

O.90.5—7

1.20.4—6

1.50.2—4

2.00.1—3

实验用1.2％琼脂糖。

称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。

（二）胶板的制备

1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。

2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。

注意：

DNA样品孔应朝向负电极一端。

5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。

（三）加样

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1．接通电泳槽与电泳仪的电源。

DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。

2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。

（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可），在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。

注意：

溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。

[实验结果]

在紫外灯（360nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶。

DNA存在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用）。

实验四DNA重组

[实验原理]

DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5'端的磷酸。

这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。

一般的连接条件是在12-16℃，反应12-16小时（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。

连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1．恒温摇床

2．恒温水浴

3．恒温培养箱

4．小型高速离心机

（二）材料

1．氨苄青霉素

2．BamHI

3．HindIII

4．T4DNA连接酶

5．pQE-31和pUC18-CAT质粒

6．培养皿

7．接种针

8．金属涂棒

9．1.5mL离心管

10．酒精灯

11．镊子、灭菌牙签等

（三）试剂

DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit，申能博彩公司）

[实验步骤]

（一）质粒DNA

用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT质粒。

（二）制备重组DNA

1．在灭菌的1.5mL离心管中，加入pQE-31质粒10L（2g／L），2L酶切缓冲液，1LBamHI和HindIII酶的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7L，至反应混合物总体积为20L，离心混匀，37℃反应过夜。

2．在另一无菌1.5mL离心管中，加pUC18-CAT质粒20L，加入3L酶切反应液，lLBamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30L，37℃反应过夜。

3．反应完毕后取5LpQE-31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。

酶切完全，进行下一步。

4．将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。

电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。

前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。

5．将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。

操作如下：

在10LDNA样品中,加T4DNA连接酶缓冲液1L，T4DNA连接酶1L，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。

（三）转化感受态细胞

1．用实验一制备的感受态细胞（-20℃保存的）。

2．在100L的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10L连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。

同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。

[实验结果]

过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。

如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。

附：

试剂盒说明书

3SSpinDNAAgaroseGelpurificationKit

上海申能博彩生物科技有限公司

WWW．

试剂盒组成：

试剂盒组成

K131（50次）

K132（100次）

K133（250次）

3SCo1umn

CollectionTube

SolutionSN

SolutionB

WashSolution（a）

TE

说明书

50支

50支

30m1

10m1

22m1

10m1

1份

100支

100支

60m1

10m1

2X22m1

10m1

1份

250支

250支

150m1

25m1

5X22m1

10m1

1份

注：

（a）首次使用前，必须在WashSolution瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用。

每次

使用后将瓶盖盖紧，以保持WashSo1ution中的乙醇含量。

（b）TEpH8．0或者水均可以用于洗脱，测序样品请用水洗脱。

试剂盒DNA回收率：

3S柱对100bp以上的DNA片段有较好的结合性能和回收率，回收率在60％以上。

主要用途：

（a）TBE或TAEAgarose胶中回收DNA片段。

（b）从溶液中回收和浓缩DNA，去除反应体系中的蛋白质。

操作步骤

从Agarose胶中回收DNA：

1．用Agarose胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下要回收DNA的琼脂块，放入1．5m1离心管中。

判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波长UV，在UV下照射的时间应尽可能短。

2．按每100mgAgarose胶加入400lSolutionSN，置于55-65℃水浴中5分钟，中途混匀，至胶完全融化。

胶融化后每400lSolutionSN加入100lSo1utionB，混匀。

注意；高浓度的胶（1．5-2％），每100mg胶加入500lSolutionSN，加热融胶的时间延长到15分钟，以保证胶全部融化，胶融化后加入100lSolutionB，混匀。

3．将3S柱放入2m1收集管中，将融化的胶溶液转移到3S柱中，让盖子开着，室温放置2分钟。

盖上离心管盖（盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子），室温离心（10，000rpm）1分钟。

4．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入600lWashSolution，室温离心（10，000rpm）1分钟。

5．重复步骤4一次。

6．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，室温高速离心（10000rpm）2分钟。

7．将3S柱放入一根新的1．5m1离心管中，在3S柱子膜中央加入30lTE或水，室温放置2分钟。

注意：

提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率。

也可以用预热的TE或水洗脱。

8．盖上离心管盖（盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子），10，000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

从溶液中回收和浓缩DNA：

1．根据溶液的体积和所要回收DNA的含量，加入5倍体积的SolutionSN。

如果溶液的体积不足100l，加TE补足到100l，再加500u1SolutionSN和100lSolutionB，混匀；

2．以下同从Agarose胶中回收DNA的步骤3-8。

实验五转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查

一般情况下，可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。

以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。

操作方法如下：

1.使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基（LB）上生长至菌落直径达1mm左右。

2.用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。

至少挑选20个左右的菌落照此划线，平板于37℃培养过夜，然后保存于4℃，直到相应菌落的回收。

3.在划线培养的同时，将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50L灭菌的10mmo1／LEDTA（pH8.0）的1.5mL离心管中。

4.每管加50L配制的0.2mo1／LNaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振荡30秒。

5.于70℃温育5分钟，然后冷却到室温。

6.加3L2mol／