大肠杆菌SPA的提取表达及鉴定.docx

大肠杆菌SPA的提取表达及鉴定.docx

《大肠杆菌SPA的提取表达及鉴定.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠杆菌SPA的提取表达及鉴定.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

大肠杆菌SPA的提取表达及鉴定

SPA的提取、表达及鉴定

班级：

08级生物技术试验班

学号：

................

姓名：

指导老师：

.....

......

时间:

2010年9月13日～11月19日

目录

§1前言（背景介绍）............................................................................................3

1.1SPA介绍.......................................................................................................3

1.2实验原理.............................................................../......................................5

§2材料与方法........................................................................................................7

2.1实验材料.......................................................................................................7

2.2实验方法.......................................................................................................8

2.2.1试剂的配制、灭菌及无菌接种.........................................................8

2.2.2蛋白的提取......................................................................................9

2.2.3SDS-PAGE检测表达的蛋白质..........................................................10

2.2.4westernblotting..........................................................................11

§3实验结果与讨论..............................................................................................12

3.1结果汇总.....................................................................................................12

3.2结果讨论.....................................................................................................13

3.3注意事项.....................................................................................................14

参考文献................................................................................................................15

§1前言

1.1SPA介绍

1.1.1SPA简介

金黄色葡萄球菌A蛋白（StaphylococcalProteinA、简称SPA）是细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。

SPA占整个细胞壁蛋白成分的6.7%，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。

其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。

1.1.2SPA的理化性质

SPA是一种蛋白质,由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。

由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。

紫外光谱和吸收系数为A275nm%=1.65，等电点为pH5.1。

SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。

其分子量因测定方法不同而有所差异。

1.1.3SPA的免疫学性质

Spa能与人以及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合,结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、猴、小鼠、及牛；对马、犊牛、山羊等无亲和力：

对所有的鱼类、两栖类、爬行类、鸟类（除少数例外）均不结合，结婚的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。

研究表明：

IgG与APS的结合部位是CH2和CH3的交界处,这种结合不会影响免疫蛋白的活性。

1.1.4SPA的生物学特性

　　1．免疫原性与过敏原性SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。

SPA－IgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。

SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。

　　2．抗吞噬作用由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。

因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。

　　3．固定补体SPA－IgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物（如豚鼠、猪、狗等）血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。

　　4．促有丝分裂因子SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。

5．去封闭作用固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。

1.1.5SPA的应用

　　SPA应用很广，但所有应用的原理都离不开SPA具有与IgG的Fc段的结合能力，主要应用方面如下：

　　1．SPA菌的协同凝集作用：

用已知的标准血清，吸附到SPA菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶性的。

此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要SPA菌体及粗制免疫血清即可。

所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。

目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。

2.作为广谱第二抗体：

用SPA代替抗体IgG的第二抗体，有如下优点：

①SPA制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的IgG都能应用,不受种属限制。

而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制；②SPA的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为103L/克分子，结合后对IgG的活性无影响。

无论在0℃、37℃、44℃及56℃几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗体在较长的孵育中，出现抗原分解的问题也可以得到解决；③SPA容易标上125I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；④在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的Fc受体结合。

SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受体影响，所以有较高的抗IgG特异性；⑤用第二抗体做免疫沉淀试验时，必须将抗免疫球蛋白的浓度调整至等价，才能产生最佳的沉淀作用。

而用SPA菌沉淀，不受此限制，能保证彻底的沉淀；⑥SPA与lgG结合是可逆的，用4mol/L尿素、4mol/L硫氰酸、盐酸（pH2.5）或鸟嘌呤盐酸盐等都可以使之重新解离。

3.用于提取纯化IgG利用SPA与IgG的结合特性提取IgG，比常规采用硫酸铵、Sephadex柱，DEAE柱或免疫梯度离心等法要简便得多，而且纯度好。

　　4.检测和提纯IgMIgM在病毒的早期诊断中具有重要意义，为了检测特异性IgM抗体，必须首先在血清中除去IgG。

采用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的办法，利用此法也为IgM的提纯开辟了道路。

　　5.其它方面：

用于免疫复合物的检测、体外激活补体功能试验、细胞表面标记以及肿瘤表面抗原的检测以及免疫电镜上的应用等。

1.2实验原理

1.2.1蛋白的提取与纯化

IMAC（ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography）是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。

同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。

1.2.2SDS-PAGE检测表达的蛋白质

蛋白质分子是两性电解质分子，在直流电场内可以移动，PAGE过程中具有三种物理效应：

1.凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）颗粒小、呈球形的样品分子移动快，颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶孔洞时的阻力大，移动慢。

2.不连续系统对样品的浓缩效应:

⑴凝胶层的不连续：

浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时的阻力小，移动快，而在小孔径中，移动慢。

因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

⑵缓冲液离子成分及pH的不连续：

在两层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷（Tris）及HCI。

Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子，HCI在任何pH值溶液中均易解离出氯离子，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。

电极缓冲液中的甘氨酸（Gly）在pH8.3的缓冲液中其解离度很小，仅为0.1％－1％，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。

血清中，大多数蛋白质等电点在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面出，被浓缩成极窄的区带。

三者的有效迁移率为m氯α氯>m蛋白α蛋白>m甘α甘（m为迁移率，α为解离度），当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子及甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。

蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分成多个区带，因此分离胶之间pH的不连续性可控制其迁移率。

在浓缩胶中要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品在快慢界面之间被浓缩。

进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。

⑶电位梯度的不连续性：

电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关。

电泳开始后由于快离子迁移率大，就会很快超过蛋白质，在快离子后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区。

低的电导区就具有较高的电位梯度，而高的电位梯度又使蛋白质和慢离子在快离子后面加速泳动。

当三者的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，三者的泳动速度就相等。

在快慢离子的移动速度相等的文台建立后，二者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。

而蛋白质的有效迁移率在快慢离子之间，因此也就聚集在这个移动附近，被压缩成一个狭小的中间层。

3.电荷效应当进入pH8.9的分离胶后，各种血清蛋白质所带静电荷不同，而有不同的迁移率。

表面电荷越多，则迁移快；反之则慢。

因此各种蛋白质按电荷少，分子量大小及分子形状以一定的顺序排列形成一个个区带。

不连续聚丙烯酰胺凝胶系统所具备的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应大大提高了它的分辨率。

1.2.3westernblotting

Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

§2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1试剂：

⑴培养基的制备接种：

大肠杆菌BL21（DE3）plyS、pETDuet-1表达载体、蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、氨苄青霉素、75℅酒精、LB培养基20ml（胰蛋白酶0.2g,酵母提取液0.1g,NaCl0.2g）。

⑵诱导表达：

①5×M9盐溶液100ml：

Na2HPO48.55g，KH2PO45g，NaCl0.25g，NH4Cl0.5g。

②M9100ml：

5×M9盐溶液20ml,1mol·L-1MgSO40.2ml，1mol·L-1CaCl20.01ml，20％葡萄糖2ml，水78ml，0.1g·ml-1AMP0.1ml。

③IPTG

⑶蛋白质的提取纯化：

①PBS500ml：

Na2HPO4·12H2O1.45g,KH2PO4·2H2O0.1482g,NaCl4.25g,PH7.0-7.4。

②溶菌酶0.8mg·ml-1。

⑷SDS-PAGE试剂：

①2MTris-HCl：

称取4.84gTris碱，加50ml蒸馏水,缓慢的加约0.8ml浓盐酸,让溶液冷却至室温后,PH会上升,加蒸馏水至20ml②1MTris-HCl：

称取2.42gTris碱,加10ml蒸馏水,缓慢加约1.6ml浓盐酸至PH6.8,让溶液冷却至室温后,PH会上升,加蒸馏水至20ml③A液：

称取9.73g丙烯酰胺和0.267g双丙烯酰胺加水至30ml。

④B液：

75ml2MTris-HCl，4ml10%SDS，21ml蒸馏水。

⑤C液：

50ml1MTris-HCl，4ml10%SDS，46ml蒸馏水。

⑥10%过硫酸铵：

将0.1g过硫酸铵加到1ml蒸馏水。

⑦电泳缓冲液：

1.5gTris碱，7.2g甘氨酸，0.5gSDS，加蒸馏水至1L，PH约8.3。

⑧5×样品缓冲液：

0.6ml1MTris-HCl，5ml50%甘油，2ml10%SDS，0.5ml　2-巯基乙醇14.4NmM/L，1ml1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

⑨12%分离胶：

4mlA液，2.5mlB液，3.5mlH2O，50ul10%AP，5ulTEMED。

⑩5%堆积胶：

0.67mlA液，1mlC液，2.3mlH2O，30ul10%AP，5ulTEMED。

⑪考马斯亮蓝染液：

0.5g考马斯亮蓝R-250，225ml甲醇，225ml蒸馏水，50ml冰醋酸。

⑫考马斯亮蓝脱色液：

50ml甲醇，50ml冰醋酸，400ml蒸馏水。

⑬标准蛋白marker。

⑸Westernblotting试剂：

①转移缓冲液：

1200ml蒸馏水中加入6.06gTris，28.82gGly，400ml甲醇，加蒸馏水至2000ml。

②封闭液：

含5%脱脂奶粉，0.05%Tween-20的PBS缓冲液。

③洗涤液：

0.5%Tween-20的PBS缓冲液。

④抗体稀释液：

含5%脱脂奶粉，0.2%Tween-20的PBS缓冲液。

⑤显色剂：

16mgDAB，80ul30%H2O2，加0.01mol/LTris-HCl至总体积20ml，现配现用。

⑥PBS缓冲液（PH7.4）：

在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl，0.2gKCl，3.632gNa2HPO4·12H2O，0.24gKH2PO4·2H2O，用HCl调节PH至7.4，加水定容至1L高压灭菌。

2.1.3器材：

试管、三角瓶（500ml）、培养皿、牙签、离心管（50ml）、移液器移液枪、无菌操作台、不锈钢手提式高压灭菌锅、小型号台式离心机SIGMA、摇床、超声波粉碎器、电炉、垂直板电泳槽、电泳仪、烧杯、摇床、电泳仪，转移电泳槽、硝酸纤维素膜、玻璃培养皿、酒精灯、牙签、恒温培养箱、1.5ml离心管、培养皿、无菌枪头、无菌离心管、调速多用振荡器———国华、稳压稳流电泳仪JY-600PJ北京君意东方、光照培养箱250-D国华仪器、恒温振荡器CHA-S国化企业、数显鼓风干燥箱GZX-9240MBE上海博迅实业有限公司医疗设备厂、MJ-300BS-Ⅱ霉菌培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司、JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司、TGL20M离心机湘麓离心机中国•长沙、调速多用振荡器HY-4国华电器有限公司、STGMA1-14离心机美的电冰箱美的集团电冰箱制造有限公司

2.2实验方法

2.2.1试剂的配制、灭菌及无菌接种（2010年9月17日）

2.2.1.1按上述配方依次配制以下试剂：

①5×M9溶液100ml

②LB培养基的制备：

⑴称取1g蛋白胨、1g氯化钠、0.5g酵母提取物放于烧杯中，加适量水，搅拌溶解。

用PH试纸调节PH值约7.0。

定容至20ml后倒入500ml的三角瓶中，塞上棉塞，并用报纸和棉线扎紧瓶口。

将试管放入灭菌锅，121℃灭菌20min。

③1mol/LMgSO450ml和1mol/LCaCl250ml

④20%葡萄糖100ml

2.2.1.2将上述配制好的试剂放在灭菌锅中,121℃灭菌20min。

2.2.1.3将灭菌好的试剂全部放在超净台上，待LB培养基的烫手后立即加100ul氨苄青霉素溶液（0.1g/ml）并混匀。

趁热将培养基倒入3个平板。

2.2.1.4将上述灭菌过的试剂按配方混合配制100mlM9溶液。

2.2.1.5无菌接种：

培养基凝固后，用接种环蘸取菌液，将菌种划线接种于固体培养基表面。

平板放在37℃培养箱中倒置培养过夜。

2.2.2SPA的原核表达（2010年9月20-24日）

2.2.2.1挑单菌落：

在上个星期的平板中的获取单菌落于试管（5mlLB-AMP+培养基）中,37℃，150rmp，震荡过夜。

2.2.2.2扩大培养：

次日，将5ml菌液接种入含100mlM9-Amp+培养基的锥形瓶中扩大培养，37℃，150rpm振荡培养4-5小时，至细菌达到对数生长期（取样品A11mL置于EP管中，4℃，12000r/min离心10min收集细菌沉淀，弃去上清；向沉淀中加入10ul水和100ul2×SDS凝胶加样缓冲液，重悬后煮沸10min，离心8min，取得沉淀于EP管）。

2.2.2.3诱导表达：

将扩大培养的菌种迅速进行低温（冰水浴）冷却5分钟，于15℃，150rpm振荡培养45分钟后。

加IPTG（终浓度为0.8mmol/L）诱导，继续于15℃，150rpm振荡培养4天。

（取样品A21mL置于EP管中，4℃，12000r/min离心5min收集细菌沉淀，弃去上清；向沉淀中加入10ul水和100ul2×SDS凝胶加样缓冲液，重悬后煮沸10min，离心8min）（在加IPTG之前先取1ml出来贮存，作为诱导前使用）。

2.2.3蛋白质的提取（2010年9月27日）

2.2.3.1离心收取培养的菌液：

将上述培养液4℃，8000r/min离心20min，收集细菌沉淀。

2.2.3.2用PBS液洗沉淀一次。

SDS-PAGE试剂的配制:

按上述配方配制。

2.2.3.3用PBS重悬（20ml/菌）。

2.2.3.4加溶菌酶（0.8mg/ml）混匀。

2.2.3.5超声波粉碎细胞,离心取上清液。

把混合菌体在冰水中用超声探头破碎10min。

粉碎后菌体溶液变浑浊。

2.2.3.6将ep管放在离心机上离心，在转速为1000/min,温度为4℃的状态下，离心20-30min。

2.2.4SDS-PAGE检测表达的蛋白质

2.2.4.1分离胶制备：

按配制10ml12%分离胶，混匀后用移液枪将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，用1ml移液枪取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，以进行水封。

约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。

倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。

2.2.4.2堆积胶的制备：

按配制10ml5%堆积胶，混匀后用移液枪将分离胶加到已聚合的分离胶上方，轻轻将梳子板插入堆积胶内，避免带入气泡。

约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。

待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板旁的金属丝以上，即可准备加样。

2.2.4.3上样：

⑴将装样品的EP管和标准蛋白样品的EP管插在泡沫中，在烧开的水中煮沸10min，取上清液于EP管。

⑵从左第2、3孔加A1（诱导前）、A2（诱导后）各15ul；从右第2、3、4孔加A2、A1、marker各20ul；其他孔全部加10ul上样缓冲液。

2.2.4.4电泳：

将电泳仪和电泳槽相连。

将电泳槽电源插头与适当的电极相接。

电流应流向阳极。

开始时将电压调至120v进入分离胶时，将电压调至150v。

迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。

2.2.4.5剥胶：

拔掉固定板，取出玻璃板。

戴上手套避免将手印留在电泳胶上。

用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，在水中左右震荡，让胶自行脱落。

2.2.4.6染色：

在室温下，将胶置于盛少量考马斯亮蓝染液的平板内，盖上盖子，放在摇床上轻摇30min。

2.2.4.7脱色：

弃去染液，换上考马斯亮蓝洗脱液洗，盖上盖子，在摇床上摇20min。

再换上考马斯亮蓝染色液，盖盖子，过夜。

2.2.4.8记录：

次日12：

00，将凝胶放在白色底的瓷盘里拍照记录。

2.2.5westernblotting

2.2.5.1按配方配制试剂：

转移缓冲液、