基因工程原理讲义：目的基因的分离.docx

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第十章 目的基因的分离

中国科学院遗传与发育生物学研究所

第十章 目的基因的分离

一、引言

1.基因分离技术发展简介

2.基因分离技术迅猛发展的客观要求

3.目的基因的分离

二、分离克隆基因的若干主要方法

1.应用核酸探针分离克隆的目的基因

2.应用差别杂交法或扣除杂交法分离克隆的目的基因

3.低丰度mRNA之cDNA末端的快速扩增RACE法

4.根据蛋白质家族的保守序列鉴定新的相关基因

5.通过表达载体分离特异的cDNA

三、应用mRNA差别显示技术分离目的基因

1.引言

2.mRNA差别显示原理

3.mRNA差别显示实验过程及其局限性

四、DNA标签法分离目的基因

1.原理

2.转位子标签法

3.T-DNA标签法

五、酵终双杂交与单杂交体系

1.酵母双杂交体系

2.酵母单杂交体系

3.酵母三杂交体系

第十章 目的基因的分离

一、引言

1.基因分离技术发展简介

*1.在上个世纪70年代中期已经具备了分离基因的能力

这主要是取决于当时重组DNA技术的发展水平，特别是发展出了安全的寄主菌株和克隆载体：

第一个安全的大肠杆菌寄主菌株——X1776品系的诞生第一批安全适用的克隆载体pM19和pBR322的问世

在上述这两个条件的基础上，分子生物学家成功地克隆出第一批基因。

*2.在上个世纪70年代末期克隆基因分离的能力明显提高

这主要应归功于基因克隆策略的改变。

由于发展出了改良的寄主菌株和克隆载体，人们提出了先克隆cDNA再分离目的基因的新策略。

*3.在上世纪80年代克隆基因分离技术得到了进一步的提高

20世纪80年代之后，由于如下技术的进步，使人们分离克隆

基因的能力得到进一步提高，这些技术主要有如下几项：

a.寡核苷酸合成技术的改良；

b.操作RNA和DNA的酶学方法的进步；

c.PCR技术的发展与应用；

*4.目前科学家们已经掌握了先进的分离克隆基因的能力

就目前的能力而言，可以说几乎任何期望克隆和分离的目的基因都是有可能被分离出来的。

其主要原因是：

a.技术的进一步发展；

b.基因组全测序工作的迅速进展与成功；

c.未知产物的发育调节基因分离技术的发明，例如mRNA差别显示技术

基因定位克隆技术

DNA标签技术等

2.基因分离技术迅猛发展的客观要求

近年来基因分离技术的迅猛发展，特别是产物未知的发育调节基因分离技术的发展尤为迅速，已发展出了基因定位克隆技术、

mRNA差别显示技术、DNA标签法分离目的基因的技术（包括

T-DNA标签法和转座子标签法）、以及酵母双杂交和单杂交技术。

有关这些技术我们在下面章节中，都将作详细的叙述。

归纳起来，近年来基因分离技术迅速发展的主要原因有如下三点：

A.人类基因组计划

人类基因组的复杂性：

MW=2.9×109bp，约有6×109核苷酸对

和近100000个基因。

经过千百万年的分化和繁衍，今天全世界有50多亿人口，因此人类基因之正常与异常的突变形式更是千百倍于基因的基本数目。

1988年9月，美国最负盛名的分子生物学家，DNA双螺旋结构的发现者之一Watson在众望所归之下，接受美国卫生研究院的邀请出任“人类基因组解读计划”的负责人，开始了令全世界科技界瞩目的“基因圣战”。

——这是场追猎人类致病基因的圣战。

1992年4月10日下午1时，Watson在冷泉港实验室内将辞呈传真到华府卫生研究院给顶头上司BernadineHealy，希利在接到辞呈后不说一句慰留的话，立即批准。

Watson辞职的原由分析：

他们两人的冲突始于基因专利事件。

Watson：

是一位才华横溢的诺贝尔奖得主，在学术界极负众望。

Healy：

是一位哈佛医学院出身，从事科学行政工作多年，是美

国生物医学界权倾一时的官员。

Watson是一位典型的传统科学家，他主张科研应以增进人类福利为目的，因此科研成果应该与世人共享，不得私藏。

面对当前的基因研究狂潮，他最担心的是会引发一阵淘金热，妨碍科学合作。

Hearly观点恰恰相反，她最感兴趣的是如何将科学成果转换成技术及经济实力。

在未征询Watson意见的情况下，径自提出有关基因专利的建议。

*专利事件引发了国际压力、预算争夺战、NIH内部政治生态复杂化，使Watson觉得不堪负荷。

于是提前一年拂袖而去，回归研究天堂

——冷泉港实验室。

专利事件没有因人事更迭而顺利解决，研究所夹带的汹涌暗潮正一波又一波地展现出它的威力，基因研究已深深地介入人类社会的个个角落。

人类基因组计划专利事件深深地激发人们去发展特异基因的克隆分离技术，成为基因克隆分离技术发展的强大动力。

B.基因分离与农业育种

全世界范围内的人口膨胀对粮食需求的增加，要求应用基因工程技术培育高产、抗病、抗逆的农作物新品种。

农作物遗传转化技术的建立为基因工程在农业中的应用奠定了良好的基础。

在80年代末90年代初期，随着植物基因工程研究的不断深入，绝大多数具有重要经济意义的农作物品种的遗传转化方法都

已经建立。

例如：

（1）1992年，Nature杂志上发表了通过基因工程操作将耐寒植物品种的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因转化进低温敏感的品种，结果改变了后者的膜脂组成，从而明显地增强了低温敏感品种的生存能力。

（Nature,1992,356,710-713）

（2）1992年，Science杂志上发表了将ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因导入土豆，成功地转化进土豆，从而导致在土豆的块茎中出现超量的淀粉的累积。

（Science,1992,258,287-292）

（3）抗病的转基因烟草的培育成功等。

这些成功事例，使植物遗传育种学家清楚地认识到，经济作物的产量、质量、抗病性以及抗逆能力等许多优良品质特性，都可以通过业已成熟的遗传转化予以实现。

但是局限于目前已经确定并克隆的具有优秀品质特性的基因寥寥无几，因而使得许多优良的经济作物之间无法产生更加完善的转基因作物。

由此可见，转基因作物的培育，主要的制约因素已不是遗传转化技术，而在很大程度上是取决于植物基因克隆分离技术的进展。

C.染色体cDNA全序列测定的局限性

于已知的DNA序列中确定基因（寻找基因）有两种方法，其一是应用计算机分析法，比较综合数据库中不同物种的序列，其中保守序

列可能是有关基因的编码区；其二是全序列筛查。

这些办法有相当的困难。

例如水稻叶绿体基因组全序列早已测定，其中仍有一些开放读码结构的编码产物是未知的。

再如，酵母3号染色体DNA全序列中测出了共182个开放读码结构（ORF），其中已确定有31个是存在于该染色体上的基因，29个与数据库中已知基因网络，另有122个的开放读码结构（占总数2/3强）还不了解它们的功能和生物表型。

鉴检基因组中大量的DNA序列是所谓冗余的序列，也就是说基因组大部分序列并无重要的生物学功能，因此有的科学家争议说全序列测定是否有必要，并且认为全序列图并无多大研究价值。

以上叙述表明：

（1）一些有理论研究或生产应用价值的基因（如人类的致病性基因）仅占全序列的极少部分，按部就班地测序不可能优先筛选出这类基因；

（2）基因组中大部分序列（至少在目前的认识水平上看）并无重要的生物学功能，而且1-2个个体的基因组全序列并不包含大量的有重要生物功能的正常多态序列和异常突变序列（这样看来全序列可能没有很大的研究价值）；

（3）基因组全序列测定工作，耗资巨大，一般发展中国家的财力难以承受，而以美国为首的国家又提出所谓“基因专利”问题；

（4）医疗卫生临床实践和农业生产中的优良品种的培育之迫切要

求；

正是居于上述这种种原因，国际上有关基因组研究的重点已从过去的全序列测定转向与表型相关的重要基因的克隆与分离。

因而伴随着有关基因的克隆与分离的技术也得到相应的发展。

这也可以说是，为什么我今天要作这个学术报告的原因所在。

3.目的基因的分离

*1.构建了基因文库（诸如cDNA文库、基因组DNA文库、BAC库以及YAC库等待），可以说是已经实现了基因的克隆，但并不等于完成了目的基因的分离；

*2.不论是基因组文库还是cDNA文库，事实上都是没有目录可查的“基因图书馆”，我们并不知道其中究竟哪一个克隆含有我们所需要的目的基因序列。

a.基因分离定义

从适当类型的基因文库中，筛选出含有目的基因的特定克隆的过程，叫做克隆基因的分离，简称基因分离或目的基因的分离。

b.基因分离的主要步骤

DNA文库的构建：

DNA分子与载体的重组及转化寄主细胞；

↓ cDNA文库及基因组DNA文库的构建；

探针分子的制备：

↓ 同位素标记法及非同位素标记法菌落杂交及阳性克隆的筛选

↓

重组体克隆的鉴定

↓

核苷酸序列的测定

↓ 酶切图谱的构建核苷酸序列的测定

*基因功能的鉴定

c.基因分离的主要方法

基因分离可区分为产物已知的目的基因的分离，和产物未知的目的基因的分离两大类型

基因分离的主要方法有：

a.应用核苷酸探针分离克隆的目的基因；

b.应用差别杂交或扣除杂交分离克隆的目的基因；

c.应用PCR技术分离克隆的目的基因；

d.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因；

e.应用表达文库分离克隆的目的基因；

f.应用DNA插入作用分离目的基因：

T-DNA插入法分离目的基因转位子插入法分离目的基因

g.应用酵母双杂交或单杂交体系分离目的基因；

h.应用基因定位克隆技术分离目的基因。

二、分离克隆基因的若干主要方法

1.应用核酸探针分离克隆的目的基因

根据已知的蛋白质序列设计合成的寡核苷酸探针

如果没有天然的核苷酸的探针可用来筛选克隆，那么人们往往根据编码蛋白质氨基酸序列资料设计和合成探针，但这有两个问题：

第一，寡核苷酸探针必须是特异地识别目的cDNA序列，而不会识别其它无关的cDNA序列。

只特异地识别真核cDNA文库所有cDNA序列中一段唯

一序列的寡核苷酸探针至少得由15-16个核苷酸组成。

而

我们通常使用的寡核苷酸探针的长度是17-20个核苷酸，

因此这就要求我们至少得掌握有关蛋白质序列中6个连续核苷酸的氨基酸序列资料。

第二，遗传密码的简并问题

有些氨基酸可由多达6个不同的密码子编码，因此这6个氨基酸序列可以由许多不同的DNA序列编码。

正是由于这个原因，寡核苷酸探针通常是以按各种可能的序列结构混合合成的寡核苷酸探针库（图7-6）。

例如Leu即有6个不同密码子：

UUA，UUG，CUU，CUC，

CUA和CUG

在这种寡核苷酸探针库中，只有一种寡核苷酸探针具有正确的基因核苷酸序列结构。

这个方法一个不便之处是，序列正确的寡核苷酸探针仅占寡核苷酸文库分子群体的一小部分，蓁部分大量的其它寡核苷酸探针有可能同无关的cDNA杂交而产生出相法数量的“假阳性”。

*克服“假阳性”办法之一——“猜测体”探针的应用

“猜测体”（Guessmers）的定义：

猜测体（