生物理学学士毕业论文木蹄层孔菌Lac的酶学性质研究.docx
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生物理学学士毕业论文木蹄层孔菌Lac的酶学性质研究
木蹄层孔菌Lac的酶学性质研究
摘要
本文对木蹄层孔菌漆酶的酶学性质进行了研究。
结果如下：
以ABTS作为底物，酶反应的最适温度为50℃；最适pH值为3；在40°C以下保持酶活力相对稳定，50°C酶活性基本全部丧失；在pH值3.5~4范围内保持相对较高的酶活力。
10mM/L的Ba2+、Ca2+、Co+、Fe3+、Na+、K+这六个金属离子对漆酶酶活有较强的抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最强，而Mg2+，Cu2+对两种漆酶均有激活作用。
以ABTS为底物时，漆酶的Km值为0.05mmol/L。
关键词：
木蹄层孔菌，漆酶，酶学性质
ENZYMATICPROPERTIESSTUDYOFtinderfungusLACCASE
ABSTRACT
Inthispaper,thetinderfungusenzymologypropertiesoflaccasewerestudied.Resultsareasfollows:
toABTSassubstrate,theenzymereactionoftheoptimumtemperatureis50℃;TheoptimalpHvalueis3;Enzymeactivitystabilizationareunder40°C,basicallloseenzymeactivityunder50°C;WithinthescopeofthepHvalueof3.5~4remainedrelativelyhighenzymeactivity.10mm/LCo+,Ca2+,Ba2+,Fe3+,Na+,K+thesixmetalionsonlaccaseenzymeactivityhadastrongerinhibitoryeffect,oneofthestrongestinhibitoryeffectofFe3+,andMg2+,Cu2+effectontwokindsoflaccaseareactivated.ABTSassubstrates,laccaseKmvaluetendencyfor0.05L.
Keywords:
tinderfungus，laccase，enzymaticproperties
目录
第1章绪论1
1.1木蹄层孔菌国内外研究进展1
1.2漆酶国内外研究进展1
1.2.1漆酶理化性质2
1.2.2漆酶的应用3
第2章材料和方法4
2.1实验材料与仪器4
2.1.1菌种4
2.1.2实验材料、试剂4
2.1.3实验仪器5
2.2实验方法5
2.2.1木蹄层孔菌的培养5
2.2.2粗酶液的制备6
2.2.3漆酶酶学性质6
2.2.5数据统计和分析7
第3章结果与分析8
3.1最适反应pH值及pH稳定性8
3.2最适温度及热稳定性9
3.3金属离子及抑制剂对漆酶活性的影响10
3.4Km11
第4章讨论12
致谢12
参考文献12
第1章绪论
1.1木蹄层孔菌国内外研究进展
木蹄层孔菌（Fomesfomentarius（L.:
Fr.）Kick.）是一种多孔菌科的高等药用真菌，是世界性分布的木腐性真菌[1]。
它们生长在北美洲及欧洲的桦木属及水青冈属。
单一颗树上就可以有多个子实体。
木蹄层孔菌并不能食用，由于其担子果可以阴燃几个小时，故可以用来点火。
子实体大至巨大，马蹄形，无柄。
多呈灰色，灰褐、浅褐色至黑色，有一层厚的角质皮壳及明显环带和环梭，边缘钝。
菌管多层，软木栓质，多年生，生于栎、桦、杨、柳、椴、榆、水曲柳、梨、李、苹果等阔叶树干上或木桩上。
子实体和菌丝体中都含有许多具有生物活性的物质，代表物质就是木蹄多糖[3、4]。
往往在生境阴湿或较黑暗的生境出现棒状畸形子实体。
分布于我国香港、广东、广西、云南、贵州、河南、陕西、四川、湖南、湖北、山西、河北、内蒙古、甘肃、吉林、辽宁、黑龙江、西藏、新疆等地区[2]。
在18世纪和19世纪，木蹄层孔菌曾被用来作为止血的膏药，在一些传统的药典中被用来作为针灸的工具[5]。
在中国和亚洲其他许多国家，木蹄子实体水煎服广泛用于治疗食管癌、胃癌、口腔溃疡、肠胃失调、发炎和各种感冒等疾病[6-7]。
国内外对木蹄的研究结果表明，木蹄具有显著抑制肿瘤细胞生长、增强机体免疫功能和抗氧化等功效。
目前，对木蹄层孔菌的研究主要是对其甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、正丁醇的提取物的抗肿瘤活性进行研究[5]。
有学者对木蹄层孔菌子实体化学成分做研究表明其含有酚、有机酸、苷类等[8]。
研究表明其子实体和菌丝体中都含有许多具有生物活性的物质，其中的多糖具有抗肿瘤和免疫刺激活性。
1.2漆酶国内外研究进展
漆酶即多酚氧化酶，是一种蓝色多铜氧化酶家族的糖蛋白氧化酶，它利用分子氧作为氧化剂，氧化木质素中酚型单元成为酚氧游离基，同时还原分子氧生成水。
在ABTS存在时，能氧化木质素中的非酚型单元，并且其催化过程不需要H2O2参与，因此它在催化木质素降解时有一定的优越性[9]。
漆酶按来源可分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶，其中以真菌漆酶为主。
在产漆酶的真菌中最重要的是担子菌中的白腐菌。
白腐真菌漆酶通常以多重基因编码的同工酶形式出现，有来源广泛、单电子氧化还原电位高、可以催化降解多环芳烃类物质等特点[10]。
由于漆酶底物的广泛和人们对漆酶介质的不断研究，漆酶的商业用途也越来越广泛。
目前漆酶的研究主要集中于对漆酶的酶学性质研究，酶活测定，发酵条件研究这方面，已有利用漆酶降解木材中的木质素、生产酒精和利用漆酶区分吗啡和可卡因的先例[11]。
1.2.1漆酶理化性质
1.2.1.1漆酶催化反应机理
漆酶的作用底物具有广泛性，但对氧具有专一性。
漆酶催化苯酚类芳香胺等物质的整个催化过程大致包括：
酶分子对底物的作用、电子在酶分子中的传递、氧分子对酶分子的还原。
就酚类化合物和芳香胺类化合物而言，漆酶利用氧分子作为电子受体，从被氧化的底物分子中，通过单电子提取方式从多酚类化合物的o-位和p-位的-OH和芳胺中去除一个H原子，形成自由基，该自由基不稳定，进一步发生聚合或解聚反应，引起重排、二聚、烷基-芳基断裂、苄醇氧化、侧链和芳环的断裂或生成醌等一系列的非酶促反应。
在氧的存在下，还原态漆酶被氧化，氧分子被还原为水。
漆酶催化不同类型底物氧化反应的机理主要表现在两方面：
一方面是底物自由基中间体的生成。
在这一过程中，漆酶从被氧化的底物分子中提取一个电子，使之形成自由基，该自由基不稳定，可进一步发生聚合或解聚反应。
在O2存在下，还原态漆酶被氧化，O2被还原为水。
另一方面，漆酶催化底物氧化和对O2的还原是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的。
漆酶催化4个连续的单电子转移氧化还原性底物，将分子氧还原为水。
还原性底物结合于T1cu位点，T1Cu从中提取1个电子，该电子通过Cys-His途径传递到T2/T3Cu三核中心位点，该位点结合了第二底物分子氧，接受T1Cu的电子，并传递给氧，使之还原为水[12]。
1.2.1.2漆酶底物的专一性
漆酶的作用底物具有较大的广谱性，初步统计，漆酶催化氧化不同类型的底物已达250个，而且还有增加的趋势，底物结构大致可归纳如下[l2]：
酚类及其衍生物:
如2，6—二甲氧基酚，愈创木酚等。
这一类底物最容易被氧化；芳胺及其衍生物：
如邻联茴香胺。
这类化合物结构与酚类相似，比较容易被氧化；羧酸及其衍生物：
如咖啡酸，阿魏酸等，也可以被氧化；一些人工合成的化合物：
如ABTS等非酚类化合物也可以作为漆酶的底物；金属有机化合物：
这类底物主要有二茂铁类化合物；其它化合物:
这类底物主要包括苯环上连有轻基、烷氧基、氨基、氯代化合物及多环、稠环化合物、杂环化合物等。
1.2.2漆酶的应用
漆酶作为一种高效，绿色的催化剂，随着固定化技术的不断发展，扩大了漆酶的工业应用范围和前景，固定化酶在废水处理，生物传感器，食品行业方面中有着重要的应用价值。
1.2.2.1废水处理的应用
造纸工艺中需要去除木质素，传统高温蒸煮去除木质素的纸浆得率低且污染环境，而漆酶能选择性地催化木质素降解的这个特性可用于纸浆生产，减少环境污染，杜绝废水。
这是漆酶最有前景的应用[13]。
漆酶还可用作纸浆的生物漂白。
漆酶来源广泛、使用方便，降解木质素效率高，固定化后能更有效的发挥作用。
目前，漆酶介导系统己经得到了实际应用[12]。
1.2.2.2食品工业中的应用
在饮料方面的应用：
除去啤酒和果汁等饮料原料中的酚，提高啤酒质量和透明度。
另外，漆酶还在食品分子的交联、改善生面团的性质、增加酱油风味、去除食品异味等工艺中发挥着重要作用。
在食用菌和药用菌方面的应用：
在食用菌制种过程中加入漆酶制剂能加速木质素的分解，能为菌丝提供更丰富的养料，加快菌丝吃料，缩短培养时间。
利用这种方法培养木耳、香菇等将有益于节约成本和扩大生产规模[14]。
1.2.2.3环境保护中的应用
去除氯酚类有机化合物：
很多研究表明，漆酶具有转化酚型底物的能力，其中包括氯酚、甲基酚、甲氧基酚等。
在底物聚合过程中，有氯离子从溶液中被释放出来，这表明漆酶具有去除氯酚化合物毒性的作用。
染料降解：
在印染和造纸等工业过程中，大量含有染料的废水释放，成为当今主要的环境问题之一。
白腐菌漆酶具有广泛的底物专一性，可以氧化芳香环化合物，对纺织染料的脱色及降解效果明显。
1.2.2.4生物检测中的应用
漆酶在催化过程中消耗氧气，这一过程很容易被转化为电信号而高灵敏地得到检测。
在免疫检测中，漆酶有望替代辣根过氧化物酶成为新的标记酶，因为它有如下几个优点：
氧气作为第二底物，不形成非产物型的酶-底复合物；相比于过氧化物酶，漆酶对介质中不同价态的金属离子浓度的敏感性较低无需特殊的仪器和试剂。
同时由于漆酶能够催化多种酚类物质生成酚类化合物，固定化漆酶电极作为生物传感器在酚类物质的检测中应用广泛[15]。
第2章材料和方法
2.1实验材料与仪器
2.1.1菌种
木蹄层孔菌（东北林业大学遗传学实验室提供）
2.1.2实验材料、试剂
马铃薯、葡萄糖、琼脂、麦麸、玉米、木屑、可溶性淀粉、麦芽糖、酵母汁、蛋白胨、牛肉膏、ABTS（1mM）、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH3）、75%的酒精.
表2-1微量溶液的配制
药品
含量/L
MgSo4
3g
MnSo4
0.5g
Nacl
1g
FeSo4.7H2o
0.1g
Cacl2
0.1g
ZnSo4.7H2o
0.1g
CuSo4
0.1g
Kal（So4）2.12H2o
10mg
NaMoO4.2H2o
10mg
次氮基三乙酸酯（NTA）
1.5g
表2-2液体培养基配制
药品
含量/L
白桦木屑
10g
酒石酸铵
0.2g
KH2PO4
2g
MgSO4
0.5g
CaCl2
0.1g
琥珀酸
（二）甲酯
10mM（1.3ml）
微量元素
70ml
硫胺素（VB1）
1mg
2.1.3实验仪器
紫外可见分光光度计、恒温箱、烘箱、高压湿热灭菌锅、干热鼓风超净台、可调控温度摇床、冰箱、刀、锅、电磁炉、打孔器、镊子、三角瓶、烧杯、容量瓶、棕色试剂瓶、移液枪、离心管、高速冷冻离心机、离心机、磁力搅拌器、酸度计。
2.2实验方法
2.2.1木蹄层孔菌的培养
2.2.1.1PDA培养基
在烧杯中加入300ml蒸馏水，将土豆去皮切成5mm的小方块。
去除掉虫蛀和坏的，称取200g土豆料放入纱布中包好，再讲纱布放入烧杯中，将烧杯置于沸水中煮30min，拿出烧杯，将纱布挤干，再称取葡萄糖20g加入土豆汤中，用蒸馏水定容至1L，加入适当琼脂（20g左右），用封口膜封口备用。
2.2.1.2活化菌种
在微波炉中溶解土豆培养基，移入超净工作台，将培养基分装在灭菌的培养皿中，等其形成固体后，再分别接上菌种。
接菌完成后，用封口膜封好连接口，移入恒温培养箱培养，温度设定为28，在无光条件下培养10天，每天观察菌的生长情况。
2.2.1.3配制液体培养基，接菌培养
配制液体培养基（表2-2），将配制好的液体培养基平均分配到100ml三角瓶中，每瓶中加入15ml培养基。
在超净工作台上将活化好的菌种接到液体培养基中，每瓶培养液中用打孔器打入3个菌饼进行培养，为测酶活做准备。
2.2.2粗酶液的制备
取培养10天的培养物4.5ml，分别加入3个1.5ml的离心管中，20°C，12000r/min，离心20min，弃沉淀，取上清液，此即为测酶活所用的粗酶液。
2.2.3漆酶酶学性质
在大离心管中依次加入100mM的酒石酸钠（pH4.0）300μL，1mM的ABTS1.5mL，蒸馏水700μL，酶液预热后取500μL加入到离心管中混匀，转移到比色皿中在420nm波长下进行吸光光度值的测定，计算酶活。
2.2.3.1不同温度对漆酶的影响和漆酶的热稳定性
最适酶活温度：
将酶和pH的缓冲溶液、ABTS、蒸馏水分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的温度下预热3min后混合测酶活，共9个处理，每个处理3个重复，取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶的最适酶活温度。
最佳耐受温度：
将酶和pH的缓冲溶液、ABTS、蒸馏水分别在20℃、30℃、40℃、50℃下进行预热，共4个处理，每个处理3个重复，各处理1h，处理完毕迅速放入冰里，混合然后在30℃测酶活。
其中20、30、40三组设定24h的对照。
2.2.3.2不同pH对漆酶的影响和漆酶的pH稳定性
最适pH：
将酶液分别和pH值1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的缓冲溶液、ABTS、蒸馏水分别在30℃预热10min，混合测酶活，共8个处理，每个处理3个重复，测量三组酶活数据取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶酶活最大时候的最适pH值。
pH耐受：
将酶液分别和pH为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0的缓冲溶液、ABTS、蒸馏水30℃水浴1h后混合测酶活，共9个处理，每个处理3个重复，其中3.5、4.0、5.0三组设定24h的对照，温度为4，测量三组酶活数据取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶pH耐受的范围。
2.2.3.3不同金属离子对漆酶的影响
除了底物外，反应体系（100mM酒石酸钠300μl、1mMABTS1.5ml、酶液500μl、H2O685μl/550μl、0.2M金属离子和抑制剂15μl（1mM）/150μl（10mM））混合在30°C预热10min后混合测酶活。
15μl（1mM）金属离子和抑制剂加685μl蒸馏水，150μl（10mM）金属离子和抑制剂加550μl蒸馏水，以酶液事先灭活后的反应混合液为对照，测定各金属离子对漆酶酶活力的影响。
2.3.3.4漆酶酶促动力学
Km即酶促反应达到最大半反应速率时的底物浓度。
在最适pH和最适温度下，测定lac在不同浓度ABTS时的酶活。
做出lac的酶促动力学曲线，计算酶活。
2.2.5数据统计和分析
根据查证，漆酶酶活的计算公式如下[16]：
酶的活性单位u/L=△A/Min×（106÷ε）×（TV÷SV）和u/L=△A/Min×（103÷mε）×（TV÷SV）。
酶的活性单位式中，△A／min为每分钟吸光度（A）净增或净减的数值；ε为摩尔消光系数；mε为毫摩尔消光系数；TV为反应液的总体积（ml）；SV为样品的体积（ml）。
3ml反应体系中稀释后的酶液为0.5ml，100mM的柠檬酸缓冲液（pH3）为300ul，1mM的ABTS溶液1.5ml，蒸馏水700ul。
于420nm处测定其吸光光度值，酶液最后加加完后立即测定，测定漆酶与底物反应1min的吸光度。
以同体积的蒸馏水为对照组。
已知420nm处ABTS摩尔消光系数ε420=3.6×104L/（mol·cm）[17]。
第3章结果与分析
3.1最适反应pH值及pH稳定性
图3-1体系pH值对酶活力的影响
图3-2酶的pH稳定性
在相同温度下，漆酶相对酶活随pH的变化如图3-1所示，漆酶的最适反应pH值为3。
漆酶的pH耐受如图3-2所示。
当pH低于2的时候，漆酶的酶活极低；处理1h时，pH为3.5和4时酶活都较高，处理24h后酶活仍能保持在60.30%~63.42%。
处理1h时，当pH大于4，酶活降级较快。
故在pH为4的时候，漆酶的酶活最稳定。
3.2最适温度及热稳定性
图3-3温度对酶活力的影响
图3-4酶的热稳定性
如图3-3所示，在反应温度为50°C的时候，酶活最高，故酶的反应最适温度为50°C。
在相同pH下，漆酶温度的耐受性见图3-4。
处理1h时，30°C酶活力最高，20°C次之，而40°C酶活损失一半多，50°C基本丧失。
处理24h时，20°C漆酶耐受性最好，同时发现处理1h和处理24h的漆酶酶活相差很小。
因此可知该酶热稳定性较差，温度低于40°C还较稳定，高于50°C就基本失活。
3.3金属离子及抑制剂对漆酶活性的影响
表3-1激活剂和抑制剂对漆酶活力影响
抑制剂种类
不同浓度抑制剂（mmol/L）作用下的相对活力（%）
1
10
EDTA
103.46
92.23
DDT
1.77
1.38
NaN3
1.56
1.28
图3—5金属离子对酶活影响
如图3—5所示，10mM/L的ba2+、ca2+、co+、fe3+、na+、k+这六个金属离子对漆酶酶活的抑制作用都很强，其中fe3+对漆酶酶活的抑制作用最强，Cu2+、zn2+、mn2+、mg2+对漆酶酶活的抑制作用一般。
1mM/L时，fe3+的抑制作用最弱。
激活剂和抑制剂对酶活影响如表3—1所示，10mM/LDDT、EDTA、NaN3均对漆酶的酶活性有着抑制作用，其中NaN3的抑制作用最强。
1mM/LEDTA对酶活有激活作用。
3.4Km
图3—6漆酶
图3—7米—曼氏方程双倒数图
由图3—6得出，当ABTS的浓度为0.35mM/L时，漆酶的吸光度数值为最高。
此时酶活为213.36u/L。
根据图3—7双倒数图公式，计算得Km=0.05mmol/L。
第4章讨论
白腐真菌木蹄层孔菌漆酶酶活的温度和pH耐受实验表明，木蹄层孔菌产漆酶的最佳培养温度为20°C，温度过高则会引起漆酶减产，超过50°C漆酶酶活丧失。
漆酶在温度为50°C的时候酶活最高，但时间久了酶活会逐渐丧失。
故测定漆酶酶活最佳温度为50°C。
随着温度的升高，漆酶的酶活下降很快，所以持续的高温会严重影响漆酶的酶活性。
对漆酶pH的耐受和最适反应实验表明，当反应体系的pH为3的时候，漆酶的酶活最高。
当培养体系的pH为3.5的时候，漆酶的酶活最稳定。
随着pH的波动，酶活的衰减并不严重，所以pH对漆酶酶活的影响系数不大。
10种不同的金属离子对两种漆酶的活性影响表明：
10mM/L的ba2+、ca2+、co+、fe3+、na+、k+这六个金属离子对漆酶酶活的抑制作用都很强，Cu2+、zn2+、mn2+、mg2+对漆酶酶活的抑制作用一般，其中fe3+对漆酶酶活的抑制作用最强，这可能是因为它占据了底物与酶的结合位点（酶的活性中心），改变了酶的构象，从而使酶活性受到了明显的抑制.由于这6种离子对漆酶的活性中心均有毒害作用，在应用漆酶时应避免在溶液中加入这6种离子。
1mM/L时，fe3+的抑制作用最弱。
，而Mg2+，Cu2+对两种漆酶均有激活作用，这与Mg2+是很多氧化还原酶的催化激活剂的特性比较一致，而漆酶也是一种氧化还原酶;Cu2+对漆酶有激活作用与Cu2+是漆酶的一个活性中心，也是漆酶分子的一个重要组成成分的特点一致。
致谢
本文是在导师尚洁讲师悉心指导下完成的。
尚洁老师平易近人，指导认真负责，经常在实验室亲自指导我的实验，解答各种疑问。
实验虽然简单，但其中数据的获取耗费了大量的时间，总共跨度达到三个月，在此期间尚洁老师一直给我们指导，帮我们答疑解惑，才使得我们的实验能顺利完成。
毕业论文定稿前尚洁老师每次修改都认真负责，小到标点符号的错误，大到文章的整体布局和数据的处理，她都会提出需要改进的地方。
在此对尚洁老师的悉心指导表示衷心的感谢！
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