气单胞菌属 AeromonasKluyver and van Niel的检验.docx

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气单胞菌属AeromonasKluyverandvanNiel的检验

气单胞菌属AeromonasKluyverandvanNiel的检验

Ø气单胞菌可分为运动性（motile）或嗜温性（mesophilic）及非运动性或嗜冷性两大类，前者以嗜水气单菌为代表，包括温和、豚鼠、凡隆、舒伯特、简达及易损气单胞菌等，其致病作用无明显区别。

临床意义：

气单胞菌为水中常居菌可引起哺乳动物（如人、鸟类等）和冷血动物（如鲑、鱼、蛇等）的感染在人类主要引起肠道内感染和肠道外感染

气单胞菌常引起5岁以下儿童和成人的肠道内感染，是夏季腹泻的常见病原菌之一，其主要的致病物质为溶血毒素和细胞毒素等。

肠道外感染主要为皮肤和软组织感染，与外伤后伤口接触污染的水有关。

2、形态及培养特性

•G-，从直杆菌到接近球状。

单个，成对或短链。

•通常以一根极生鞭毛运动（固体培养幼龄时具周生鞭毛）。

兼性厌氧。

•具呼吸和发酵两种代谢类型。

•最适生长温度22-28℃；多数种可在37℃生长，其它种最高生长温度38-41℃，最低0-5℃，pH5.5-9.0。

气单胞菌形态特征：

•革兰阴性短杆菌，有时呈球状绝大多数有极端单鞭动力阳性

•兼性厌氧营养要求不高，在普通培养基上可以生长，形成灰白色、光滑、湿润、凸起，2mm大小的菌落，在TCBS培养基上不生长。

在0°c-45°c范围内均可以生长，根据生长温度的不同，可分为嗜冷菌（37°c以上不生长）和嗜温菌（10°c-42°c之间生长）两大类。

嗜水和杀鲑气单胞菌与霍乱弧菌一样，存在所谓活的非可培养（viablebutnonculturable,VBNC）状态，实际上是一种休眠状态，其菌体缩小成球状，耐低温及不良环境，常规培养不生长。

温度回升且获得生长所需的营养条件时，细菌回复到正常状态，重新具有致病力。

3、生化性状

•对葡萄糖和其他糖类能产酸，常产气。

氧化酶和触酶阳性。

通常精氨酸水解酶阳性，鸟氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱氨酶阴性，尿酶阴性。

明胶酶和DNA酶皆阳性。

还原硝酸盐。

•多数种能发酵的糖包括麦芽糖、D-半乳糖和海藻糖。

•对抗菌抑制剂2，4—二氨基—6，7—异丙基喋啶（O/129）不敏感。

种属鉴定：

氧化酶阳性、触酶阳性、硝酸盐还原试验阳性、发酵葡萄糖和其它碳水化合物产酸或产酸产气。

4、致病性及毒力因子

Ø具有毒力因子的菌株才有致病性。

Ø其毒力因子有3类：

一是胞外产物，如毒素和蛋白酶；二是粘附素，如S蛋白、4型菌毛和外膜蛋白等；三是铁载体。

5、微生物学诊断

血平板、麦康凯平板或TSA培养基等可直接分离气单胞菌。

从动物腹泻粪便分离则需采用RS选择培养基。

分离菌为革兰氏阴性，氧化酶和触酶阳性。

同时可凭O129等其它关键生化指标进行判定。

分离株是否有致病性，则还需检测胞外蛋白酶和溶血素等毒力因子，可用脱脂奶平板和血平板划线培养，或用相应抗体建立的ELISA试剂盒检测。

6、常见种类

✓嗜水气单胞菌（A.hydrophila）杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）

（一）嗜水气单胞菌（A.hydrophila）

1形态与染色特性

•G-,两端钝圆、直或略弯的短小杆菌，0.3-1.0×1.0-3.5µm，多数单个存在，少数双个排列。

•通常菌体一端有单鞭毛，幼龄培养在菌体四周形成鞭毛，但对数生长期过后，该细胞又呈极生单鞭毛。

无荚膜，不形成芽孢。

2培养特性

（1）兼性厌氧。

在普通琼脂、TSA、麦康凯琼脂、SS琼脂上生长良好，血平板β溶血，TCBS或6%NaCl中不生长，对弧菌抑制剂O/129不敏感，一般不发酵乳糖。

（2）普通琼脂平板菌落:

直径2-3mm,圆形、表面光滑、边缘整齐、中央隆起、灰白色、半透明。

（3）在溴化十六烷基三甲铵琼脂上不生长。

在TSA平板28℃培养18-24h，菌落呈淡黄褐色，无水溶性色素。

（4）最适生长温度28℃，最高38-41℃，一些菌株可在5℃生长，pH6-11（7.2-7.4），盐浓度0-4%（0.5%）。

3生化性状

Ø水解淀粉和精氨酸、发酵甘露醇、赤藓糖醇、棉子糖、果胶糖：

+

Ø苯丙氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶、MR、V.P、氧化酶、触酶试验：

+

4抵抗力

Ø水中常见菌，一般夏季较多、冬季减少。

是鱼肠道菌群之一。

鱼和动物分离株较环境分离株的蛋白质分解能力强。

对热抵抗力较差，60-65℃,30min-1h死亡。

Ø对氯霉素、土霉素、氟苯尼考、链霉素、四环素、磺胺嘧啶，硝基呋喃等具抗性的菌株被筛选。

从这些菌株分离到相应可转移抗药性质粒。

5抗原性

运动性气单胞菌有O、H和K抗原

运动性气单胞菌与杀鲑气单胞菌及其他属细菌也存在共同抗原成分

6致病性与致病因子

Ø嗜水气单胞菌对多种鱼、两栖类及爬虫有致病性，可引起鳗鲡赤鳍病、红点病、烂鳃病；鲤鱼和金鱼竖鳞病；鲢鳙鱼打印病；青鱼和草鱼肠炎；青鱼疖疮病；香鱼红口病；甲鱼“红脖子病”；蛙红腿病；蛇败血病和口炎。

Ø此外，还可导致鱼类败血症。

称为运动性气单胞菌败血病。

感染人类引致急性胃肠炎，是食品卫生检验对象。

Ø本菌主要通过肠道感染，鱼体受伤或寄生虫感染时可经皮肤和鳃感染，并与水温、有机质含量，饲养密度等密切相关。

水温24-28℃死亡率较高，10℃以下不发病。

致病因子

（1）毒素:

包括溶血素及肠致病性毒素。

溶血素分α和β2种。

α溶血素能引起家兔注射局部的硬结、毛细血管充血和皮肤坏死，对Hela细胞、绿猴肾细胞、成纤维细胞和Y1肾上腺细胞具有毒性，可致动物败血性肠炎。

β溶血素毒性较强，静注0.4μg即可导致小鼠死亡，引起家兔皮肤坏死。

肠致病性毒素可分为3种，即霍乱样肠毒素、细胞兴奋型肠毒素和细胞毒肠毒素。

（2）蛋白酶:

酪蛋白酶、纤维蛋白酶、胶原酶、葡萄球菌溶解素等,这些均与本菌的毒性有关。

（3）外膜蛋白：

与细菌的黏附相关。

7微生物诊断

细菌分离培养：

TSA；

生化试验：

一般不分解乳糖，对O/129不敏感；葡萄糖产气，发酵甘露醇、蔗糖，利用阿拉伯糖，水解七叶苷/水杨苷，鸟氨酸脱羧酶阴性。

致病因子：

检测胞外蛋白酶、溶血素、外膜蛋白等；

血清学检查：

玻片/试管/微量凝集；

动物感染试验。

（二）杀鲑气单胞菌（A.salmonicida

1形态与染色特性

ØG-短小杆菌，长度不到宽度的两倍，0.8-1.0×1.0-1.8µm，通常成双、短链或成丛状排列。

无鞭毛、无动力、不形成芽孢和荚膜。

2培养特性

兼性厌氧，生长需精氨酸和蛋氨酸。

普通琼脂上22℃培养48h后，形成圆形、隆起、边缘整齐、半透明、松散菌落。

多数菌株在含酪氨酸和苯丙氨酸的TSA、FA（Furunculosisagar,疖疮病琼脂）上产生水溶性褐色素，但厌氧下不能产生色素。

血琼脂上快速溶血，7天后菌落变成淡绿色。

生长温度5-35℃（22-25℃），生长pH6-9（7），盐浓度0-3%

3生化特性

●阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、糊精、精氨酸水解：

+

●山梨糖、山梨醇乳糖、棉子糖、纤维二糖：

-

●KCN肉汤、7.5%NaCl营养肉汤生长：

-

●氨基甲酰磷酸激酶\脂酶、腺嘌呤3,2-单磷酸激酶：

+

●脲酶、鸟氨酸脱羧酶（ODC）和连四硫酸盐还原酶：

-

4抵抗力

Ø本菌在蒸馏水存活4d至2w，灭菌河水28d（20-25℃）、灭菌湿土40d（20-30℃）不死亡。

Ø强毒株在含有机质淡水中可存活15w，在死鱼肾脏存活28d（4℃）、在海水中10d内死亡。

Ø对土霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、喹啉酮、噁啉酸等敏感。

Ø许多抗生素只能抑制其繁殖，不能将其杀灭。

5抗原性

Ø杀鲑气单胞菌各亚种间具有共同的O抗原。

此外，不产色亚种还具有亚种特有的抗原。

杀鲑气单胞菌与本属的其他种也存在共同抗原成分。

6致病性与致病因子

致病性：

主要感染鲑科鱼类，为鲑科鱼类疖疮病病原。

Ø细菌通过患病鱼、带菌鱼和污染水水平传播。

入侵门户主要是受伤皮肤，也可通过胃肠道和鳃感染。

致病因子

Ø本菌病因与细胞壁表面的A层（additionalcellsurfacelayer;A-layer）和胞外产物（extracellularproducts;ECPs）有关。

Ø有毒菌株的细胞壁都有A层，主要由50kD的蛋白质组成，因此又称A蛋白层。

A蛋白的氨基酸序列类似于大肠杆菌的K88菌毛和胎儿弯杆菌的微荚膜，可吸附于宿主细胞。

此外，还可帮助该菌获取铁离子，避免血液中补体的溶解和吞噬细胞的吞噬。

Ø有A层的菌体悬浮于盐溶液时往往产生自凝现象。

这些菌株可凝集鲑鳟鱼类的红细胞，但不凝集鲤科鱼类和哺乳动物的红细胞。

杀鲑气单胞菌的胞外产物（ECP）至少由25种蛋白构成。

包括溶血素、鲑溶解素（salmolysin）、杀白细胞素、细胞性糖蛋白及酪蛋白酶、骨胶原酶等。

7微生物学检查

（1）涂片镜检取病鱼的血液、脏器等涂片，革兰氏染色，可见革兰氏阴性的短杆菌。

（2）分离培养取病鱼肾脏或体表溃疡的病健交界处组织，接种于TSA或FA平板，20-28℃培养，检查有无产褐色素的菌落并进行革兰氏染色。

（3）对苯二胺试验将1%对苯二胺溶液倾注在上述平板中培养后形成的菌落上，杀鲑气单胞菌形成的菌落在90s内，从褐色变成黑色。

（4）血清学检查玻片凝集反应、间接血凝、荧光抗体技术常应用于分离菌鉴定和本病的诊断。

进行玻片凝集反应时，预先用超声波对分离菌做短暂处理，可防止自身凝集。

此外，乳胶凝集反应和金黄色葡萄球菌协同凝集试验亦为本病的快速诊断方法。

还可采用ELISA诊断方法。

（5）带菌鱼的检测带菌鱼体中病原菌含量少，用常规方法不易检出。

应将其转移到高水温饲养，并注射免疫抑制剂以促进病原菌的繁殖，再按上述方法进行诊断。